反相色谱法测定菊花中咖啡酸衍生物和黄酮类成分

宋 程 陈存武 孙传伯 韩邦兴 何晓梅*

（1.皖西学院生物与制药工程学院， 安徽六安237012； 2.安徽省石斛产业化开发协同创新中心， 安徽六安237012； 3.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室， 安徽六安237012）

雪菊Sanvitaliaprocumbens Lam.又名蛇目菊、双色金鸡菊，为菊科金鸡菊属一年生草本植物。雪菊原产于美国中西部地区，在我国部分地区作为保健茶和药材大面积栽培。野生雪菊生长在昆仑山脉海拔3 000 m 雪线境内，花期短，产量少。雪菊作为药用菊花的一种，其中黄酮类表现出较强的抗氧化、清热解毒、降压、降脂等功效［1⁃2］。目前，关于雪菊化学成分的研究主要集中在总黄酮、总皂苷、总多糖和氨基酸［3］，还有研究报道雪菊与菊科杭白菊、贡菊中绿原酸、木樨草苷、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸和槲皮苷几种药用成分的差别［4］。2015 年版《中国药典》 “菊花” 项对菊花干燥品中绿原酸、木樨草苷和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸的最低含有量也有明确限定［5］。然而，雪菊中类黄酮含有量丰富，且化学组成各异，其主要化学成分并不限于药典规定。雪菊相对其他品种菊花色泽更深，暗示可能积累较多的原花青素和花色苷。本实验在已研究4 种成分的基础上，增加对雪菊中色素合成前体儿茶素、表儿茶素以及二氢杨梅素、杨梅素的检测，以期建立新的雪菊活性成分评价指标。利用反相色谱法检测雪菊与几种商品菊花中咖啡酸衍生物和黄酮类成分的含有量，以期用于菊花的质量评价。

1 材料

1.1 材料 雪菊1 号至雪菊5 号于2016 年7 至9月分别采摘于新疆皮山县康克乡、克里阳乡、策勒县博斯坦乡、策勒镇和墨玉县芒来乡，生长地海拔平均在1 200～2 500 m，经皖西学院生物与制药工程学院何晓梅副教授鉴定为菊科金鸡菊属蛇目菊Sanvitaliaprocumbens Lam.；贡菊、杭白菊、胎菊和黄金菊购于市场，产地分别为安徽黄山、浙江杭州、浙江杭州和湖北荆州，见图1。干菊花经高速万能粉碎机研磨成粉，室温避光、干燥储存。

图1 不同产地样品Fig.1 Samples from different growing areas

1.2 仪器与试剂 Agilent 1260 系列高效液相色谱仪、Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱（美国Agilent 公司）；Milli⁃Q Advantage A10 超纯水仪（德国默克密理博有限公司）；RE⁃52 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SB⁃5200DTD 型超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。乙腈、甲醇（色谱级，美国Tedia 公司）；甲酸（色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。绿原酸、槲皮苷对照品 （纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；3，5⁃二咖啡酰奎宁酸、木樨草苷对照品（纯度≥98%，成都曼斯特生物科技公司）。儿茶素、表儿茶素、二氢杨梅素和杨梅素对照品［纯度≥99%，西格玛奥德里奇（上海） 贸易有限公司］。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 精密称取雪菊和菊花粉末各0.25 g，置于圆底烧瓶中，加入70% 甲醇25 mL，超声处理（120 W，40 kHz） 40 min，放冷，摇匀，滤过。续滤液旋转蒸发至干，加入2.5 mL 70%甲醇溶解，经0.22 μm 有机微孔滤膜过滤，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸、儿茶素、表儿茶素、二氢杨梅素、木樨草苷、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸、杨梅素、槲皮苷各1 mg，溶于甲醇分别制备成1、1、1、0.1、0.5、1、0.1、1 mg／mL的对照品贮备液。每种对照品贮备液依次稀释不同倍数，配成不同浓度梯度的对照品溶液。

2.3 色谱条件 采用Zorbax Eclipse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～10%A；5～20 min，10%～15% A；20～25 min，15%～20%A；25～40 min，20%～25% A；40～55 min，25%～60%A；55～60 min，60%～5% A）；体积流量0.5 mL／min；柱温20 ℃；检测波长280 nm；进样量5 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取不同浓度的对照品贮备液，在“2.3” 项色谱条件下进样，记录峰面积。以对照品含有量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行回归，结果见表1。表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度试验 分别称取对照品1 mg，按“2.2” 项下方法制备成1 mg／mL 混合对照品溶液。在“2.3” 项色谱条件下进样6 次，测得绿原酸、木犀草苷、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸、槲皮苷、儿茶素、表儿茶素、杨梅素、二氢杨梅素峰面积RSD分 别 是 1.28%、1.02%、0.812%、1.69%、1.30%、1.69%、1.49%、0.707%。表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 精密吸取同一混合对照品溶液，在“2.3” 项色谱条件下，分别于0、2、4、8、16、24 h 进样，测得绿原酸、木犀草苷、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸、槲皮苷、儿茶素、表儿茶素、杨梅素、二氢杨梅素峰面积RSD 分别是1.64%、1.07%、0.566%、1.98%、3.07%、2.88%、0.934%、0.854%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取雪菊2 号样品6 份，在“2.3” 项色谱条件下分别进样，测得绿原酸、木犀草苷、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸、槲皮苷和表儿茶素峰面积RSD 分别为0.51%、1.14%、0.41%、0.98%、2.06%。表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取0.25 g 雪菊样品粉末3 份，置于50 mL 圆底烧瓶中，分别依次加入适量的绿原酸、木犀草苷、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸、槲皮苷和表儿茶素对照品制备成供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定。结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝3）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝3）

2.5 不同产地样品含有量分析 不同产地雪菊液相色谱指纹图谱结果显示，雪菊甲醇提取物所含化学成分具有一定的相似性，含有量差异较小，见图2。绿原酸、木樨草苷和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸作为雪菊中主要活性成分含有量较高，槲皮苷和表儿茶素含有量较低。实验中未检测到儿茶素、二氢杨梅素和杨梅素。雪菊2 号样品中绿原酸和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸的含有量都是最高的，分别达到4.39、3.89 mg／g；槲皮苷含有量最高达到1.09 mg／g。雪菊5 号中表儿茶素含有量最高为1.01 mg／g。雪菊1 号中木樨草苷含有量最高为29.68 mg／g。见表3。

图2 5 批不同产地雪菊样品HPLC 指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of five batches of S.proc⁃umbens from different growing areas

表3 雪菊中各成分含有量测定结果（，mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents in S.procumbens （，mg／g）

注：—为未检测出。

2.6 成分分析与比较 雪菊与商品菊花中所含主要化学成分差异较大。4 种商品菊花甲醇提取物中大多数物质在25～40 min （20%～25% 乙腈）时洗脱出峰，但雪菊1 号甲醇提取物主要成分出现在20～25 min （15%～20% 乙腈），见图3。绿原酸、木樨草苷、槲皮苷和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸是雪菊和商品菊花的共有峰。杭白菊、贡菊、黄金菊和胎菊的共有峰为绿原酸、木樨草苷、槲皮苷、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸和二氢杨梅素，其中杨梅素仅在胎菊和黄金菊中检测到。在4 种商品菊花中未检测出儿茶素和表儿茶素。表4 表明，贡菊中绿原酸和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸含有量最高，分别达3.98、13.46 mg／g。其中，3，5⁃二咖啡酰奎宁酸的含有量在所有菊花样品中最高。木樨草苷在黄金菊中的含有量最高达2.75 mg／g，但低于5 个产地雪菊。二氢杨梅素的含有量在4种商品菊花中普遍较低，在黄金菊中含有量最高仅为0.066 mg／g。槲皮素在4 种商品菊花中的含有量都高于昆仑雪菊，其中在贡菊中的含有量最高达到3.63 mg／g。杨梅素在商品菊花中含有量较低，仅在黄金菊和胎菊中检测到。

图3 5 批不同种类样品HPLC 指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints of five different kinds of samples

表4 4 种商品菊花中各成分含有量测定结果（，mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in four commercial chrysanthemums （，mg／g）

表4 4 种商品菊花中各成分含有量测定结果（，mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in four commercial chrysanthemums （，mg／g）

注：—为未检测出。

3 讨论

3.1 色谱条件影响 2015 年版《中国药典》 规定绿原酸、木樨草苷和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸的检测采用乙腈⁃0.1%磷酸溶液作为流动相［5］。由于磷酸添加剂易堵塞色谱柱，本实验以0.1%甲酸水溶液替代同样能得到较好的峰形。检测波长是影响物质检测灵敏度和最低检测限的重要指标。为在单一波长下同时测定上述8 种成分的含有量，需要先考察每种成分的最大紫外吸收波长。绿原酸和3，5⁃二咖啡酰奎宁酸（异绿原酸A） 两种酚酸类的最大吸收波长为328 nm［6］；儿茶素和表儿茶素属于黄烷三醇类，其最大吸收波长为 203.4、278.8 nm［7］。李向阳等［8］对金银花中木樨草苷及绿原酸等6 种成分进行测定，木樨草苷最大吸收波长为348 nm，绿原酸最大吸收波长为327 nm，异绿原酸A 最大吸收波长为329 nm。杨梅素属于黄酮醇类，二氢杨梅素属于二氢黄酮类。由于黄酮醇B 环C2⁃C3 位双键的存在，使得杨梅素和二氢杨梅素呈现2 种不同的紫外吸收特征。陈图峰等［9］对藤茶中二氢杨梅素和杨梅素含有量进行测定，得到二氢杨梅素的最大吸收峰为205、290 nm，杨梅素的最大吸收峰为208、373 nm。槲皮苷是一种黄酮醇糖苷，其最大吸收波长为256 nm［10］。综合几类成分共有紫外吸收波长，本实验最终选择280 nm 为检测波长。

3.2 不同产地雪菊主要成分比较 不同产地的雪菊化学组成相近，但含有量各不相同，可能与海拔和采收期有关。孙自增等［11］研究雪菊中主要化学成分的分布特征，运用主成分分析和聚类分析成功将昆仑山脉地区和天山山脉生长的雪菊分成两大类［12］。郭玉婷等［13］对和田地区5 个乡镇生长的雪菊中黄酮、皂苷、多糖和氨基酸含有量进行分析，皮山县克里阳乡所产雪菊中黄酮类成分含有量都较高，品质较好，其次是策勒县博斯坦乡。雪菊品质与产地海拔高度有着直接的关系，原因是海拔越高，气温越低，雪菊生长周期将延长，使得活性成分积累越多，品质越好。本实验的5 个雪菊采集地中克里阳乡海拔最高，其次是博斯坦乡、康克乡、策勒镇和芒来乡。克里阳乡雪菊中绿原酸、3，5⁃二咖啡酰奎宁酸和槲皮苷的含有量都是最高的，其次是博斯坦乡。这些结果进一步地揭示雪菊的质量与其生长海拔高度有直接关系。

3.3 雪菊与几种商品菊花成分分析与比较 雪菊与杭白菊、贡菊、黄金菊和胎菊是同科不同属植物，在黄酮类化合物组成和含有量上有明显地差异。郑大成等［14］采用薄层色谱法和定性分析法研究昆仑雪菊水溶性黄酮的组成，主要包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮及异黄酮类。王亮等［4］分析并比较昆仑雪菊与杭菊、贡菊中主要活性成分含有量，发现绿原酸、木樨草苷和槲皮苷含有量在雪菊中都是最高的。本实验中，不同采集地雪菊中绿原酸含有量普遍高于4 种商品菊花，木樨草苷含有量是4 种商品菊花的10 余倍，但槲皮苷含有量都较低。李素云等［15］检测细胞内代谢过程中槲皮素、槲皮苷及其甲基化产物的存在形态，指出槲皮素及其衍生物结构不稳定致其极易氧化降解，因此雪菊材料采摘后应干燥、密封保存。值得注意的是，表儿茶素仅在雪菊中被检测到，未在4 种商品菊花中检测到。表儿茶素作为原花色素合成的前体，后期聚合形成缩合单宁，在多酚氧化酶的催化下进一步地氧化成有色醌类［16］，这可能与雪菊呈现深棕褐色有关。二氢杨梅素在黄酮醇合成酶的催化下合成杨梅素，是无色花青素合成的前体［17］。本实验在贡菊、杭白菊、胎菊和黄金菊中都检测到二氢杨梅素，在胎菊和黄金菊中检测到杨梅素，但都未检测出表儿茶素，可能是积累在胎菊和黄金菊中的杨梅素合成的黄烷三醇类较少，因此其花色相对雪菊更浅。