HPLC 法同时测定外感风痧颗粒中9 种成分

刘 雯 郭海姣 刘进宝 罗宇东 王先军 周丽园 覃洁萍*

（1.广西中医药大学药学院， 广西南宁530001； 2.广西国际壮医医院， 广西南宁530200； 3.广西中医药大学制药厂， 广西南宁530023）

外感风痧颗粒为国家颁布标准品种、广西传统特色优势壮药，组方源自壮族民间验方，由苍耳草、狗仔花、藤苦参、山芝麻、岗梅、两面针6 味药材配方而成，功效祛风清热，主治风热感冒、咽喉肿痛，但其现行标准中只有性状项和理化鉴别项，无法有效控制其质量。目前，关于该制剂质量控制的报道较少，仅涉及藤苦参、岗梅TLC 定性鉴别及绿原酸含有量测定［1］。

本实验通过查阅文献［2⁃8］，对外感风痧颗粒中各药材所含成分进行分析，发现苍耳草主要含有酚酸、蒽醌；藤苦参根中主要含有皂苷、糖类、甾醇等成分，其中强心苷是其主要药效物质；山芝麻根主要含有三萜；岗梅成分以三萜皂苷为主，也含有酚酸及少量甾体、单萜；两面针根主要含有生物碱、苯丙素、黄酮、三萜、酰胺等化合物；狗仔花含有苯丙素、甾体、脂肪醇、脂肪酸等成分。通过对照品比对、紫外光谱解析、文献［9⁃11］ 并结合课题组前期研究［12］，建立了HPLC 法同时测定外感风痧颗粒中原儿茶酸、新绿原酸、隐绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的含有量，再通过聚类分析、主成分分析对其进行化学计量学研究。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色谱仪，配置四元泵、柱温箱、可变波长检测器 （美国Waters 公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SQP 电子分析天平［百万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］。外感风痧颗粒共10 批（批号20180101、20180301、20180304、20180401、20180402、20180403、20190301、20190302、20190303、20190401），由广西中医药大学百年乐制药厂提供。原儿茶醛（批号110810⁃201608，纯度99.3%）、咖啡酸 （批号110885⁃201703，纯度99.7%）、原儿茶酸（批号110809⁃201205，纯度99.9%）、绿原酸 （批号110753⁃201817，纯度96.8%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸B （批号3089）、隐绿原酸（批号3208）、新绿原酸（批号6630） 对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；异绿原酸C （批号 RP180704），异绿原酸 A （批号RP180903） 对照品均购自成都麦德生科技有限公司。乙腈为色谱纯；甲醇为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 依利特Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脱（0～5 min，8% 乙腈；5～11 min，8%～12%乙腈；11～25 min，12%～21%乙腈；25～32 min，21%～31%乙腈；32～33 min，31%～100%乙腈；33～40 min，100% 乙腈）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长273 nm （0～11.5、14～16 min）、327 nm （11.5～14 min、16～41 min）；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取原儿茶酸、新绿原酸、隐绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 对照品适量，甲醇制成各成分质量浓度分别为0.073 4、0.189 0、0.183 2、0.037 2、0.192 0、0.016 1、0.106 4、0.307 6、0.292 4 mg／mL 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取颗粒10 袋，拆掉包装，倾出内容物，精密称定质量，计算平均装量。将颗粒研细后取约10.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，称定质量，超声40 min 后取出放冷至室温，甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 系统适用性、专属性考察 精密吸取对照品、供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，相邻组分分离度均大于1.5，理论塔板数以最难分离的异绿原酸C 色谱峰计，应不少于3 000。

2.5 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，在“2.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 取“2.5” 项下对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，每次10 μL，测得原儿茶酸、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为0.93%、0.24%、0.14%、0.12%、0.14%、0.14%、0.13%、0.14%、0.14%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取6 份颗粒（批号20180301），按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件各进样10 μL 测定，测得原儿茶酸、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 含有量RSD 分别为2.2%、1.1%、2.2%、1.7%、1.5%、3.0%、2.3%、3.1%、2.5%，表明该方法重复性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号20180301），于0、2、4、8、12、24 h 在 “2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得原儿茶酸、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为1.4%、1.7%、1.7%、2.5%、1.1%、2.6%、1.8%%、2.6%%、1.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 取6 份颗粒 （批号20180301），每份约5.0 g，精密称定，按照100%水平加入对照品溶液，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下各进样10 μL测定，计算回收率。结果，原儿茶酸、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 平均加样回收率分别为 95.6%、100.7%、97.1%、97.6%、98.4%、101.4%、103.5%、102.5%、103.4%，RSD 分别为2.1%、2.3%、2.8%、1.9%、2.4%、2.6%、2.6%、2.3%、2.5%。

2.10 样品含有量测定 取10 批颗粒，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算每袋颗粒（标示装量15 g） 中各成分含有量，结果见表2。

2.11 化学计量学研究

2.1 1.1 聚类分析 通过SPSS 16.0 软件将表2 数据进行标准化运算，以标准值为变量进行聚类分析，分析方法选用组间联接，度量标准选用“平方Euclidean 距离”，标准化转换值选择“全距从0到1”，结果见图2。由此可知，10 批样品大体上被聚为3 类，其中第1 类包括20180301、20180401、20190301、20190302、20190303、20190401，第2 类包括20180304、20180402、20180403，第3 类包括20180101。

2.1 1.2 主成分分析 将表2 数据的标准化得分作为变量，通过SPSS 16.0 软件进行主成分分析，结果见表3～4。由表3 可知，前2 个主成分特征值均大于1，累积方差贡献率达91.936%，基本可以反映各成分的全部信息。由表4 可知，主成分2 主要反映咖啡酸含有量信息，而主成分1 主要反映其他8 种成分含有量信息。

表2 各成分含有量测定结果（mg／袋）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／bag）

图2 10 批样品聚类分析图Fig.2 Cluster analysis diagram for ten batches of samples

表3 主成分特征值及贡献率Tab.3 Eigenvalues and contribution rates for principal components

表4 主成分载荷矩阵Tab.4 Loading matrices for principal components

将每个原始变量转换成标准化值后显示在SPSS 16.0 软件中，再将因子载荷矩阵中的系数除以2 个主成分各自对应的特征根后开平方根，即为主成分中每个指标所对应的系数。根据系数、标准化值结合软件的计算变量功能，测定2 个主成分的得分值，并绘制得分图，结果见图3，可知10 批样品被分为3 组，与聚类分析结果一致。

图3 主成分分析得分图Fig.3 Score plot for principal component analysis

3 讨论

3.1 指标成分选择 本实验通过查阅相关文献发现，外感风痧颗粒中各药材主要成分为酚酸、蒽醌、黄酮、三萜，前期曾尝试检测蒽醌、三萜、黄酮，但均未检出。因此，本实验选择酚酸作为指标成分。

3.2 提取条件选择 本实验考察了提取方法（回流、超声、冷浸）、提取溶剂（甲醇、乙醇、70%甲醇、50%甲醇、纯水）、提取时间（20、30、40、50 min），发现甲醇超声40 min 时提取率最高，故以其为提取条件。

3.3 流动相系统选择 本实验考察了甲醇⁃水、乙腈⁃水、乙腈⁃0.2%冰醋酸、甲醇⁃0.2%冰醋酸、甲醇⁃0.2% 磷酸、乙腈⁃0.2% 磷酸，发现以乙腈⁃0.2%磷酸洗脱时各成分分离度、峰型、对称因子最佳，故以其为流动相。

3.4 检测波长选择 原儿茶酸、原儿茶醛最大吸收波长为273 nm，而其他成分均为327 nm。因此，本实验采用波长转换法，可使各成分均在其最大吸收波长下进行测定，从而提高了分析灵敏度，减小了测定误差。

3.5 化学计量学研究 聚类分析显示，10 批样品大体上被聚为3 类，第1 类20180301、20180401、20190301、20190302、20190303、20190401，第2 类20180304、20180402、20180403，第3 类20 180101；主成分分析显示，前2 个主成分基本可反映各成分全部信息，能以其对样品质量进行控制，其中主成分2 主要反映咖啡酸含有量信息，而主成分1 主要反映其他8 种成分含有量信息，与聚类分析结果一致。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定外感风痧颗粒中原儿茶酸、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的含有量，该方法准确、灵敏、可靠，重复性好，可用于该制剂的质量控制。