黄连膏提取工艺优化及其体外抗炎活性

王远茜 韩 冰 王 丹 王思明 李 娜* 赵大庆*

（1.长春中医药大学， 吉林长春130117； 2.长春金赛药业股份有限公司， 吉林长春130012）

黄连膏出自清代吴谦的《医宗金鉴》，是用于治疗皮肤创面疾病的中医经典名方，原配方为当归尾五钱、黄连三钱、黄柏三钱、生地一两、姜黄三钱，按照清代度量衡制度结合2015 年版《中国药典》 计量单位，将其换算为黄连11.175 g、当归尾18.625 g、生地黄37.250 g、黄柏11.175 g、姜黄11.175 g，总生药量89.4 g。方中姜黄破血行气，当归活血养血，生地清热生津、凉血养阴润燥，黄连清热燥湿，黄柏泻火解毒［1］，攻效清热疖肿、清热解毒、溃疡创伤，主要用于治疗肺经壅热、上攻鼻窍，致生鼻疮、干燥肿疼等，对皮肤湿疹、水火烫伤、红肿热疮、乳头碎痛也有理想疗效。近年来，该方在治疗新生儿红臀、痔疮、烧烫伤、压疮、粉刺等也呈现了良好作用，堪称中医外科之“圣药”［2⁃3］。

黄连膏以清利湿热为组方原则，对湿疹的治疗有着悠久历史［4］。湿疹是由多种因素引起真皮浅层、表皮炎症的皮肤病，目前市面上常用药物以西药为主，但大多含有激素类成分，具有较大的不良反应；中药膏剂治疗湿疹具有不良反应小、疗效好、不易复发的优势，可通过皮肤涂抹使药物直达病所，不仅能透达腠理来发挥局部治疗作用，还可经过肌肤、毛窍而深入脏腑，从而起到内外合治的目的［5⁃6］。本实验将优化黄连膏提取工艺，并选择人永生化角质形成细胞（HaCat 细胞） 作为对象对该方体外抗炎作用进行研究，以期为今后相关机制的考察提供依据。

1 材料

1.1 仪器 细胞培养箱（美国Thermo 公司，型号3131）；酶标仪 （瑞士Tecan 公司，型号infinite M200 PRO）；电子天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司，型号AL204）；粉碎机（北京锟捷玉诚机械设备有限公司，型号GS⁃05）；高效液相色谱仪 （美国Agilent 公司，型号1100）。

1.2 试剂与药物 姜黄、当归、生地、黄连、黄柏均购自宏检大药房，经长春中医药大学中药鉴定学教研室王哲副教授鉴定为正品。香油 （燕庄牌）。MEM 培养基 （美国HyClone 公司，货号SH30022.01）；胎牛血清 （货号04⁃002⁃1ACS）、1%双抗（货号03⁃031⁃1B）（美国BI 公司）；0.25%胰 酶⁃EDTA （美 国 MRC 公 司，货 号CC830031.02）；MTT 试剂盒（北京Solarbio 公司，货号M8180）；反转录试剂盒（日本TaKaRa 公司，货号PR047A）；TRIzol （美国罗氏公司，货号11667165001）；人肿瘤坏死因子⁃α （TNF⁃α）、人干扰素⁃γ （IFN⁃γ） 细胞因子（美国Biolegend 公司，货号300⁃01A⁃10、300⁃02⁃20）；胸腺活化调节趋化因子 （TARC）、巨噬细胞源性趋化因子（MDC）、调节活化T 细胞表达和分泌因子（RAN⁃TES）、白细胞介素⁃8 （IL⁃8） ELISA 试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司，货号 BPE10052、BPE10132、BPE10120、BPE10139）。

1.3 细胞株 人正常表皮永生化角质形成细胞系HaCat 细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 姜黄素总量测定 姜黄为黄连膏君药，其药理作用广泛，无毒，耐受性好，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用［7］，主要有效成分为姜黄素，在治疗炎症介导的疾病中有着重要地位，并且《中国药典》 相关检测方法实用性强，易于操作。因此，本实验选择姜黄素作为指标成分［8］。

2.1.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），填充剂十八烷基硅烷键合硅胶；流动相乙腈-4% 冰醋酸 （48 ∶52）；体积流量1 mL／min；检测波长430 nm；进样量5 μL。理论塔板数按姜黄素峰计算，应不低于4 000［9］。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取姜黄素对照品1.20 mg，甲醇制成每1 mL 含12 μg 该成分的溶液，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取黄连膏提取油5.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 甲醇，称定质量，75 ℃水浴加热回流提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以姜黄素进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝3 509.2X-3.293 3 （r＝0.999 8），在0.036～0.216 μg 范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密称取黄连膏提取油5.0 g，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，每次5 μL，测得姜黄素峰面积RSD 为0.56%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 吸取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，每次5 μL，测得姜黄素峰面积RSD 为0.72%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取同一批黄连膏提取油6 份，每份5.0 g，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，各吸取5 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得姜黄素总量RSD 为1.28%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取黄连膏提取油5.0 g，共6 份，精密加入等量对照品溶液，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得姜黄素平均加样回收率为99.1%，RSD 为0.51%。

2.2 提取工艺优化 依据《医宗金鉴》 提取工艺，取香油十二两（即加入5 倍量香油，每个处方447 g），将药“煠枯” 后捞去渣，选择药材粒度、煎炸时间、煎炸温度、浸泡时间作为影响因素，姜黄素总量作为评价指标，在前期单因素试验基础上采用正交试验优化工艺［10］。因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

方差分析见表3，可知因素B、C对提取有显著影响 （P＜0.05），而因素A、D无显著影响（P＞0.05）；各因素影响程度依次为B＞C＞A＞D，故确定D作为误差项。由表2 可知，最优工艺为A1B2C2D2，为了节省成本，缩短生产周期，最终确定为A1B2C2D1，即饮片不浸泡而直接投入5 倍量香油中，200 ℃下煎炸4 h。

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

再进行3 批验证试验。按处方取10 倍量饮片，共3 份，按上述优化工艺提取，捞出炸枯的药渣，滤过，测定提取油质量和姜黄素总量，结果见表4，可知工艺稳定可靠。

表4 验证试验结果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests （n＝3）

2.3 体外抗炎活性研究

2.3.1 细胞培养及模型建立 采用含1% 双抗、15%胎牛血清的MEM／EBSS 液体培养基，将HaCat细胞置于25 cm2培养瓶中，在饱和湿度培养箱（37 ℃、5%CO2） 中培养，24 h 后更换培养液，除去未贴壁细胞，每隔1～2 d 更换1 次培养液至细胞生长融合，待细胞贴壁达到70%～80% 时，用0.25%EDTA⁃胰蛋白酶消化液消化细胞，并进行传代［11］。

由于血清可诱导细胞因子的分泌，从而影响体外湿疹模型的建立，故采用血清饥饿法建立体外湿疹炎症模型［12］。取对数生长期的HaCat 细胞，按每孔4 000 个细胞量均匀接种于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后换无血清空白培养基饥饿细胞6 h，再更换含有不同造模浓度细胞因子的培养基中培养24 h。设置空白培养基组、10 ng／mL TNF⁃α ＋10 ng／mL IFN⁃γ 组、20 ng／mL TNF⁃α ＋20 ng／mL IFN⁃γ 组、30 ng／mL TNF⁃α ＋30 ng／mL IFN⁃γ 组、40 ng／mL TNF⁃α ＋40 ng／mL IFN⁃γ 组，每组设6 个副孔，培养结束后加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，置于37 ℃培养箱中培养4 h 后吸去培养基，每孔加入150 μL DMSO，酶标仪在490 nm 波长处检测光密度（OD），计算细胞存活率，公式为存活率＝OD药物／OD空白×100%，筛选LD50时的造模浓度［13］。

采用重复测量设计的方差分析，发现不同造模浓度TNF⁃α、IFN⁃γ 对HaCat 细胞存活率影响的差异有统计学意义（P＜0.05），并随着造模浓度升高而逐渐降低（P＜0.05）。图1 显示，当造模浓度为20 ng／mL 时，细胞存活率为50%，即为LD50。

图1 造模浓度对HaCat 细胞存活率的影响Fig.1 Effect of modeling concentration on the survival rate of HaCat Cells

2.3.2 细胞毒性试验 0.25% EDTA⁃胰蛋白酶消化HaCat 细胞后，MEM 完全培养基吹打稀释成浓度为4×104／mL 的细胞悬液，以每孔100 μL 的体积加到96 孔板中，置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。细胞贴壁后弃去完全培养基，加入空白培养基饥饿培养6 h，再加入含0.05、0.5、1、2 μL／mL黄连膏提取油的MEM 空白培养基各100 μL，以MEM 空白培养基为空白对照组［14］，每组平行设置6 个副孔，作用24 h 后每孔加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，继续培养4 h，弃去原培养液，加入150 μL DMSO 溶解，振荡3 min 使结晶物充分溶解，在490 nm 波长处检测吸光度（OD），计算细胞存活率，结果见图2。由此可知，提取油浓度为2 μL／mL 时对细胞生长有抑制作用（P＜0.01），存活率为77%，而在0.05～1 μL／mL时无细胞毒性，故最终选择0.05、0.5、1 μL／mL作为实验浓度。

图2 黄连膏提取油对HaCat 细胞存活率的影响Fig.2 Effect of Huanglian Ointment extract oils on the survival rate of HaCat cells

2.3.3 TARC、MDC、RANTES、IL⁃8 水平检测 取对数生长期的HaCat 细胞，接种于6 孔板中（每孔7×104个） 培养24 h，待细胞贴壁后更换无血清培养基饥饿细胞4 h，弃去空白培养基，以MEM 空白培养基为空白对照组，加入含“2.3.1”项造模浓度TNF⁃α、IFN⁃γ 及0.05、0.5、1 μL／mL黄连膏提取油的无血清培养基，处理细胞24 h，收集每孔上清培养基，1 000 r／min 离心5 min 以去除细胞碎片，ELISA 法检测上清培养基中TARC、MDC、RANTES、IL⁃8 水平［15］。图3 显示，TNF⁃α、IFN⁃γ 处理HaCat 细胞后TARC 水平高于空白对照组（P＜0.05），而黄连膏提取油对其水平有较强的抑制作用，并呈剂量依赖性（P＜0.01）。

图3 黄连膏提取油对TARC 水平的影响Fig.3 Effect of Huanglian Ointment extract oils on TARC level

图4 显示，TNF⁃α、IFN⁃γ 处理HaCat 细胞后MDC 水平高于空白对照组（P＜0.05），而黄连膏提取油对其水平有较强的抑制作用 （P＜0.05，P＜0.01），以1 μL／mL 更明显。

图4 黄连膏提取油对MDC 水平的影响Fig.4 Effect of Huanglian Ointment extract oils on MDC level

图5 显示，TNF⁃α、IFN⁃γ 处理后RANTES 水平高于空白对照组（P＜0.05），而1 μL／mL 黄连膏提取油对其水平有较强的抑制作用（P＜0.01）。

图5 黄连膏提取油对RANTES 水平的影响Fig.5 Effect of Huanglian Ointment extract oils on RANTES level

图6 显示，TNF⁃α、IFN⁃γ 处理后IL⁃8 水平高于空白对照组 （P＜0.05），而 0.05、0.5、1 μL／mL黄连膏提取油对其水平有较强的抑制作用（P＜0.01）。

图6 黄连膏提取油对IL⁃8 水平的影响Fig.6 Effect of Huanglian Ointment extract oils on IL⁃8 level

3 讨论

传统上，皮质类固醇（软膏、乳膏或注射剂）被认为是治疗湿疹最有效的方法［16］，但其长期应用会引起不良反应，导致临床上受到限制［17⁃18］，故迫切需要开发相关新型药物。湿疹发病机制与角质形成细胞作用的失调有关，促炎细胞因子对后者的刺激可引起炎性趋化因子产生，可专门用于招募效应细胞（如单核细胞、粒细胞、T 淋巴细胞），从而促进皮损炎症反应的发展［19⁃20］。

本实验采用正交试验对黄连膏提取工艺进行优化，发现各因素对姜黄素总量的影响程度依次为煎炸时间＞煎炸温度＞药材粒度＞浸泡时间，其中煎炸时间、煎炸温度更显著；由直观分析结果可知，最优提取工艺为将药材饮片直接投入5 倍量香油中，200 ℃下煎炸4 h。验证试验显示，该工艺准确度高，稳定可行，具有实际利用价值，可使古方工艺中的“将药煠枯” 操作标准化，为经典名方黄连膏的新剂型开发打下坚实基础。

体外抗炎活性实验结果表明，炎性趋化因子TARC、MDC 水平随着黄连膏提取油浓度升高而降低，并呈现剂量依赖性，同时高浓度（1 μL／mL）下IL⁃8、RANTES 水平基本恢复正常。由此可知，黄连膏可明显抑制炎症介质释放，减轻表皮细胞炎症反应，促进皮肤屏障恢复［21］。