环维黄杨星D对H2O2损伤大鼠心房肌细胞L型钙通道的影响*

王增夏， 关怀敏， 王贺， 邱承杰， 赵亚楠， 曹英杰， 解金红△

1河南中医药大学(河南郑州 450046)；河南中医药大学第一附属医院 2心脏中心, 3药剂科(河南郑州 450000)

环维黄杨星D(cyclovirobuxine D)是从黄杨木中提取的单体成分，临床验证具有祛风除湿、行气活血之功效。较多的临床观察发现环维黄杨星D具有抗心律失常的作用[1]。进一步研究发现环维黄杨星D可以抑制L型钙电流(ICaL)[2]。环维黄杨星D还具有抗氧化应激的作用。最近研究显示氧化应激、心房电重构与房颤的发生有关[3]，L型钙通道[4]是心脏电活动中重要的离子通道之一，ICaL是动作电位二期平台期的重要离子流。心脏的电重构可能与活性氧自由基(ROS)的过量产生有关，在心肌组织中，超氧化物、过氧化氢(H2O2)可以导致ROS水平的增加。研究表明H2O2可以用来建立细胞的氧化损伤模型[5]。药物通过影响离子通道可以起到对抗或导致心律失常的作用。膜片钳技术可直接测定膜离子通道电流的大小和细胞膜电位[6]，是研究药物对离子通道活性影响的最为直接的手段。抗心律失常药物在临床上往往有致心律失常的作用，而环维黄杨星D有关致心律失常的作用报道较少，这体现了中药具有多靶点、不良反应小等优势。2017年5月至2018年12月,本实验研究在于明确H2O2介导的氧化应激及环维黄杨星D对大鼠心房肌细胞L型钙通道电生理特性的影响，为中药环维黄杨星D治疗房颤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取清洁级成年健康雄性SD大鼠(购自郑州大学实验动物中心)36只，体重280～320 g，动物合格证编码:SYXK(豫)2017-0001；本实验研究已经通过河南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会的审查，实验动物伦理审查批准编号：YFYDW2017004。

1.2 实验试剂 10 mol/L H2O2、二甲基亚砜(DMSO)、TEA-Cl购于美国Sigma公司，胶原酶Ⅱ购于Gibco公司， HEPES、NaH2PO4、L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)、EGTA、牛磺酸(Taurine)、CsCl、Mg-ATP购于北京索莱宝科技有限公司；CaCl2购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，环维黄杨星D购于上海源叶生物科技有限公司；其余试剂均来源于国产分析纯。

1.3 溶液成分

1.3.1 无钙台式液成分 NaCl 136 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、NaH2PO4·2H2O 0.33 mmol/L、HEPES 10 mmol/L；用NaOH将pH值调至7.4。

1.3.2 KB液成分 KOH 80 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、KCl 30 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、Taurine 20 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、L-Glutamic Acid 50 mmol/L、KH2PO420 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L。用KOH将pH值调至7.4。

1.3.3 酶液 20 mgⅡ型胶原酶、10 μL 0.1 mol/L CaCl2加入到无钙台式液中，定容至50 mL。

1.3.4 记录ICaL的细胞内液成分 CsCl 130 mmol/L、Mg-ATP 3 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 15 mmol/L、MgCl2·6H2O 2 mmol/L、Glucose 10 mmol/L。用CsOH将pH值调至7.2。

1.3.5 记录ICaL的细胞外液成分 CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、TEA-Cl 136 mmol/L、Glucose 10 mmol/L。用CsOH将pH值调至7.4。

1.4 方法

1.4.1 成年SD大鼠单个心房肌细胞的分离 采用酶解法分离心房肌获得单个心房肌细胞[7]：将无钙台式液、KB液、酶液100%O2提前充氧30 min，将恒温水浴箱温度调至42℃使出口温度在37.5℃左右，调节蠕动泵使灌流速度为5.4 mL/min。SD大鼠麻醉前先腹腔注射肝素(200 IU/mL)0.3 mL，后给予10%水合氯醛(0.30 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后从剑突下剪开皮肤，开胸，迅速取出心脏，放入冰无钙台式液培养皿里，移至灌流装置处，用无齿眼科镊夹住主动脉上缘，逆行插管至主动脉根部，使插管的下缘与肺动脉的起始端水平。使用Langendorff恒流灌流装置[8]，在恒温状态下(温度保持在37.5℃)，用无钙台式液灌流2～3 min，心脏内残血排出干净后，换用酶液继续灌流2 min使台式液冲洗干净，后结扎肺静脉、肺动脉及上下腔静脉，继续酶液循环灌流约10 min，心脏有暗红色变成粉红时，用眼科镊轻轻牵拉心房肌，待心房肌组织变得松软，牵拉基本无阻力时，立刻沿房室间沟剪取左右心房，放置于KB液中，用眼科剪将心房肌组织剪碎成约1 mm3的组织块，用吸管轻柔缓慢规律吹打组织块3～5 min，当组织块被吹打成细丝絮状时，即可获得单个心房肌细胞，将含有心房肌细胞的KB液用200目的细胞筛网过滤，用小烧杯将过滤后的细胞悬液定容至10 mL，准备细胞复钙。用含有相应CaCl2浓度的KB液，依次逐步加入到10 mL细胞悬液中，使细胞悬液恢复至生理浓度，具体复钙步骤如下：第一次：2 mL KB液+12 μL 0.1 mol/L CaCl2吹打混匀后缓慢加到10 mL细胞悬液中；每隔5 min，用相同方法依次加入16、35、79、94 μL 0.1 mol/L CaCl2于2 mL KB液中，混匀后加入到细胞悬液中。复钙结束后用细胞悬液在放有细胞爬片的细胞培养板里铺板，给予相应的药物干预后，置于37℃，5% CO2孵箱中孵育，以备后续膜片钳实验使用。

1.4.2 药物配制 环维黄杨星D用无水酒精溶解(无水酒精的终浓度不超过0.1%)，加KB液制备成母液，敷药时稀释成20 μmol/L的工作液。10 mol/L H2O2[9]敷药时稀释成100 μmol/L工作液。

1.4.3 心房肌细胞的处理和药物的使用 细胞分为3组(n为细胞数)：(1)对照组(n=8)：细胞不经过任何处理直接进行膜片钳实验，记录ICaL；(2)H2O2组(n=8)：细胞经100 μmol/L的H2O2培养0.5 h后进行膜片钳实验并记录ICaL；(3)环维黄杨星D组(n=9)：细胞预先经100 μmol/L H2O2培养0.5 h后加入20 μmol/L环维环维黄杨星D培养0.5 h进行膜片钳实验并记录ICaL。

1.4.4 排除电流干扰 为确保记录的ICaL是纯净，故在细胞外液、电极内液里均不加入Na+，以此排除Na+电流干扰，在上述两种液体里分别加入TEA-Cl、CsCl 以此排除K+电流干扰。

1.4.5 刺激程序参数 (1)L型钙通道I-V曲线：钳制电压-70 mV，给予阶跃10 mV，-60 mV～+60 mV，250 ms的系列刺激；(2)L型钙通道失活曲线：钳制电位-70 mV，给予阶跃10 mV，-60 mV～+40 mV，1 000 ms的系列脉冲刺激，每一个条件脉冲后再紧跟+10 mV，250 ms的测试脉冲；(3)L型钙通道恢复曲线：钳制电位-70 mV，给予+10 mV，250 ms的刺激，间隔时间8、12、18、26、39、58、87、130、195、293、439、658、986、1 479 ms，再给予+10 mV，250 ms的刺激。

1.4.6 膜片钳全细胞记录模式 保持实验环境安静整洁，购买进口玻璃电极(美国Sutter公司)，用P-97微电极拉制仪(Sutter公司)采用五步法拉制成电阻为2.0～5.0 MΩ的电极[10]，提前将制备好玻璃微电极放入自制盒里备用，使用全细胞膜片钳技术[11]，在电压钳制下记录ICaL。将HEKA EPC-10放大器(德国)与计算机相连接。软件PatchMaster控制电压输入信号和刺激信号的采集。在倒置显微镜下挑选细胞膜完整规则，边界清晰，立体感强，表面光滑无颗粒，横纹清楚，不自主收缩的梭形细胞。从玻璃电极尾部反向充灌好电极内液，在玻璃电极进入浴液之前前，给予轻微正压，调节三维操纵仪(MP-225，Sutter公司)移动玻璃电极，使电极尖端入液，入液后进行液接电位补偿，继续移动电极尖端的使其与细胞表面刚刚接触，轻压细胞，撤去正压，再给予小的负压，使电极尖端与细胞膜之间形成高阻封接，待封接电阻达到2 GΩ以上，进行电极电容补偿，脉冲式给予负压，使细胞膜破膜形成全细胞记录模式，补偿全细胞膜电容。信号经四阶贝塞尔低通滤波器滤波，截止频率为1 kHz，采用频率为10 kHz。

2 结果

2.1 各组大鼠心房肌细胞ICaL密度及I-V曲线变化的比较 与对照组相比，H2O2组ICaL密度升高[(-4.49±0.59) pA/pFvs(-7.47±0.68) pA/pF]，差异有统计学意义(P<0.05)；与H2O2组相比，环维黄杨星D组ICaL密度降低[(-7.47±0.68)pA/pFvs(-4.95±0.48)pA/pF]，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A:对照组原始电流图;B:H2O2组原始电流图;C：环维黄杨星D组原始电流图; D：各组L型钙通道的I-V曲线；E：各组L型钙通道峰值电流的柱状图的比较；*与H2O2组比较 P<0.05

2.2 各组大鼠心房肌细胞L型钙通道稳态激活曲线变化的比较 记录各组L型钙通道的激活曲线，按照电流/电流最大值(I/Imax)=1-1/{1+exp[(Vx-V1/2)/k]} 公式进行拟合，式中Vx为不同的去极化脉冲电压，V1/2为通道激活50%时的脉冲电压，k为斜率因子，计算出各组的激活的V1/2和k值。与对照组比较，H2O2组L型钙通道稳态激活曲线左移，半激活电压V1/2从(-11.22±0.78)mV移动到(-13.83±0.99)mV，差异有统计学意义(P<0.05)；与H2O2组比较，环维黄杨星D组L型钙通道稳态激活曲线向左移动，半激活电压V1/2从(-13.83±0.99)mV移动到(-15.94±0.95)mV，差异无统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A：各组拟合的L型钙通道的激活曲线；B：L型钙通道激活曲线的刺激程序；C：各组L型钙通道激活的V1/2比较的柱状图，*与对照组比较 P<0.05；D：各组L型钙通道激活的k值比较的柱状图

2.3 各组大鼠心房肌细胞L型钙通道稳态失活曲线变化的比较 记录各组L型钙通道的失活曲线，按照I/Imax=1/{1+exp[(Vx-V1/2)/k]}公式进行拟合，式中，Vx为不同的条件脉冲电压，V1/2为通道失活50%时的条件脉冲电压，k为斜率因子，计算出各组的失活的V1/2和k值。与对照组相比，H2O2组L型钙通道稳态失活曲线变化不明显，半失活电压V1/2从(-29.44±0.81)mV移动到(-29.07±1.12)mV(P>0.05)；与H2O2组相比，环维黄杨星D组L型钙通道稳态失活曲线变化不明显，半失活电压V1/2从(-29.07±1.12)mV移动到(-30.48±0.70)mV，差异无统计学意义(P>0.05)。结果显示H2O2、环维黄杨星D对L型钙通道的失活影响无显著性差异。见图3。

注：A：各组拟合的L型钙通道的失活曲线，B： L型钙通道失活曲线的刺激程序；C：各组L型钙通道失活的V1/2比较的柱状图；D：各组L型钙通道失活的k值比较的柱状图

2.4 各组大鼠心房肌细胞L型钙通道失活后恢复曲线变化的比较 记录各组L型钙通道的恢复曲线，按照I/Imax=1-exp(-t/τ)公式进行拟合，式中，t为恢复时间常数，τ为通道恢复的时间常数，计算出各组失活后恢复的时间常数Tau值。与对照组相比，H2O2组失活后恢复曲线左移，L型钙通道恢复时间常数Tau值从(0.18±0.02)s减少至(0.13±0.01)s，差异无统计学意义(P>0.05)；与H2O2组相比，环维黄杨星D组恢复曲线右移，L型钙通道恢复时间常数Tau值从(0.13±0.01)s增加至(0.15±0.02)s，差异无统计学意义(P>0.05)。结果显示H2O2、环维黄杨星D对L型钙通道的失活后恢复影响无显著性差异。见图4。

注：A：各组拟合的L型钙通道失活后恢复的曲线，B：L型钙通道失活后恢复曲线的刺激程序；C：各组L型钙通道的失活后恢复时间常数Tau值比较的柱状图

3 讨论

研究表明[12],Ca2+处理不当是一个重要的致心律失常因素，也是房颤产生局灶性异位活动的机制之一；钙循环异常是心律失常发生的诱因，可以导致早期后除极、晚期后除极和触发活动[13]。氧化应激是机体在遭受有害刺激时，氧化系统和抗氧化系统失衡，体内ROS产生过多导致组织损伤。外源性H2O2可以使ROS产生增多，ICaL增大，100 μmol/L H2O2可以使在HEK 293细胞中稳定表达的L型钙通道电流增大[14]。本实验采用H2O2制备氧化应激模型，氧化应激不但可以导致心房重构，也可使心房电生理特性发生改变；心房电重构、炎性因子增加、氧化损伤均可能与氧自由基增加有关。氧化应激发生时ROS产生增加，进而促使心脏重构的发生[15]。

中药黄杨木首见于《本草纲目》，归心、肝、肾经，具有祛风除湿、行气活血之功。研究表明环维黄杨星D对氧化损伤的心肌有明显的保护作用，有清除氧自由基的作用[16]。环维黄杨星D可明显增加因缺氧或氧化损伤心肌细胞的存活率[17]。环维黄杨星D可增加冠脉血流量，提高心肌氧利用率，还有正性肌力作用，研究表明环维黄杨星D可以延长心房动作电位时程和有效不应期[18]。环维黄杨星D具有抗心律失常、抗心肌缺血以及正性肌力的作用，因此对心血管疾病有很好的疗效[19]。本实验研究发现环维黄杨星D可使H2O2预处理的心房肌细胞ICaL密度降低，但环维黄杨星D对L型钙通道的激活、失活、恢复曲线的影响没有统计学意义。

综上所述，环维黄杨星D可能是通过降低ICaL来改善心房电重构，环维黄杨星D对激活、失活、恢复曲线没有影响，可能是通过改变钙通道的数量来影响钙电流的大小，其具体机制还需要进一步实验研究证实。目前临床上的抗心律失常药物存在致心律失常的不良反应，黄杨宁属于Ⅲ类抗心律失常药的范畴[20]。中药环维黄杨星D的致心律失常作用很弱，且对伴有其他器质性心脏病患者得治疗有其特有的优势。因此，不良反应少的环维黄杨星D药物更适合临床长期的应用，本研究结果为环维黄杨星D的使用提供理论依据。