人凝血因子IX 基因在小鼠脂肪干细胞中的稳定表达

李杰,谢燕燕,王馨,王霖虹,和红霞,孙庆云,晏亚辉,闫振宇

(华北理工大学附属医院血液科,河北唐山 063000)

血友病B(hemophilia B)是一种X 染色体相关的隐性遗传性疾病,其发病机制为编码凝血因子IX的基因突变导致凝血功能障碍,目前尚无治愈方法[1]。 其作为一种单基因型疾病,基因治疗为该疾病的治愈提供了可能。 间接体内法(ex vivo)为基因治疗的间接途径,其实质是指通过将携带目的基因的病毒或非病毒载体转染实验动物或患者体内的组织或细胞,该组织或细胞作为靶细胞再次回输入体内,产生所需蛋白的表达。 本实验组前期已经探讨了携带hFIX 的重组腺病毒可以转染小鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC),并得到目的蛋白的表达,但未探讨腺病毒转染后,ADSC 的干性有无变化,也未进行转染后细胞是否可以进行稳定表达的实验研究。 本实验就此问题进行初步研究,探讨ADSC 转染携带目的基因的腺病毒后,干性有无改变及蛋白是否稳定表达,为ADSC 作为血友病基因治疗的靶细胞动物实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级近交系雄性 C57BL/6 小鼠 4 只,3 ～4周龄,体重20 ～30 g,购自北京华阜康动物有限公司【SCXK(京)2019-0008】,饲养于华北理工大学医学中心实验室【SYXK(冀)2015-0038】。 自由进食水,室温温度控制在(18 ～26)℃,相对湿度40% ～70%, 12 h 昼夜交替,每次 8 ～ 12 h 通风换气。 本实验通过华北理工大学实验动物伦理委员会审查,符合动物伦理要求,按照3R 原则给予人道关怀。

1.1.2 实验细胞

实验细胞为近交系C57BL/6 小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC),为本实验组进行分离培养。

1.1.3 试剂与仪器

胎牛血清(PAN,P30-2600);DMEN/F12 培养基(Corning,10-092-CVR);Pen/Strep 青链霉素 双抗 100X (Corning, 30 - 002-CI); PBS 缓 冲 液(Hyclone,02-024-1ACS);含 0.05%EDTA 胰蛋白酶(Hyclone,03-050-1B)。 重组腺病毒 Ad-F9-GFP 及Ad-GFP(上海汉恒生物科技有限公司)。碱性磷酸酶染色剂(BASO,BA4117);茜素红染色剂(Lengene,美国);逆转录试剂盒(TaKaRa,RR037 A);2 × UTaq PCR MasterMix(含染料)(ZOMANBIO, ZT201 A - 2 ); DNA Marker I(ZOMANBIO,zm101-2);Protease lnhibitor Cocktail(EDTA-Free,100Xin DMSO)(APExBIO,K1007);F9 Polyclonal Antibody(ABclonal,A1578);ACTB(ABclonal,AC026);超敏ExPlus ECL 化学发光检测试剂盒(ZOMANBIO,ZD310 A-1);人凝血因子IX(FIX)ELISA Kit(Andy gene,Human1954)。

生物安全柜(海尔集团有限公司,HR60-IIA2,中国);超净工作台(Forma Scientific,美国);CO2细胞培养箱(Forma 公司,SL-JC-2323,美国);倒置相差显微镜(Olympus,CX-24,日本);荧光电子显微镜(Nikon 公司,TI-U,日本);普通 PCR 仪(伯乐生物技术有限公司,美国);电泳仪(伯乐生物技术有限公司,美国);酶标仪(Biotek 公司,ELX800,美国);凝胶成像系统 AI600(GE,美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

本实验分为4 组,A 组：重组腺病毒Ad-F9-GFP转染首次转染细胞;B 组：重组腺病毒Ad-F9-GFP转染后细胞传代后1 代;C 组：重组腺病毒Ad-F9-GFP 转染后细胞传代后2 代;D 组：正常ADSC。

1.2.2 ADSC 复苏

将冻存ADSC 从液氮中取出,迅速置于37℃水浴锅中复溶,“8”字形滑动,注意期间冻存瓶盖及封口膜位置不可接触水浴锅中温水,避免污染。 待细胞溶解,约1 min 后将细胞快速置入含有0.5 mL 预热培养基的培养瓶中,后逐渐加入培养基至3 ～4 mL。 滴管混匀后,置于 37℃5% CO2培养箱中培养,24 h 后换液处理。

1.2.3 ADSC 的消化及传代

将细胞培养瓶中原有细胞培养液弃去,加入3～5 mL 生理盐水清洗2 次后弃去液体,注意将瓶中剩余生理盐水应用移液器去除,后加入600 μL 含0.05% EDTA 的胰蛋白酶,放入37℃细胞培养箱,2 min后显微镜下观察,细胞完全消化后加入2 mL完全培养基终止,转移至15 mL 离心管中,1000 rpm离心5 min 后弃去上清液,加入4 mL 10% FBS 将细胞吹匀后移至2 个细胞瓶中,每瓶放置2 mL 培养基,最后在每瓶细胞瓶中补充2 mL 10%FBS 培养基,放置于含有5% CO2的37℃孵育箱中培养,3 d后再次换液。

1.2.4 重组腺病毒Ad-F9-GFP 体外转染ADSC

取第3 代ADSC,计数2.5 × 105个细胞接种于12.5 cm2细胞瓶中,观察细胞生长状态,当细胞生长汇合率至70% ～80%,更换新的完全培养基,取重组腺病毒Ad-F9-GFP 按照MOI=300 转染细胞(MOI=病毒载量×体积/细胞数量,本研究MOI=300 为前期实验结果显示最佳转染MOI)。 24 h 后进行换液处理。 荧光显微镜观察荧光表达情况。

1.2.5 转染后ADSC 传代培养

首次转染后ADSC 留取足够数量细胞,其余细胞进行传代培养,至转染后第1、2 代细胞,荧光显微镜下观察荧光表达情况,传代方法同1.2.3。

1.2.6 转染后ADSC 的成骨诱导检测

取重组腺病毒转染后ADSC,观察细胞生长状态,待汇合率为60% ～70%时,依据相关文献[2-3]进行成骨诱导,并于诱导培养第7 天后进行ALP 染色,第30 天后茜素红染色。 观察转染后ADSC 的分化能力,初步探讨重组腺病毒转染后ADSC 的干性有无改变。

1.2.7 RT-PCR 检测转染后ADSC 传代后目的基因表达

依据实验分组,A 组细胞转染后72 h,B、C、D组待细胞长满细胞瓶,应用TRIzol 法提取细胞总RNA。 RNA 提取后,测定 RNA 纯度及浓度测定。样品合格后,取1 μg 提取RNA 根据试剂盒说明书进行逆转录合成。 依据 TaKaRa 逆转录试剂说明书,逆转录条件为 37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃forever。 以逆转录产物行 PCR,根据小鼠 GAPDH(179 bp)为内参,F9(118 bp)的基因序列设计引物(表1),引物送至英潍捷基(上海)贸易有限公司Invitrogen 合成。 再行 PCR 扩增特异序列,PCR 反应条件：94℃ 3 min,94℃ 30 s,60℃ 45 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min,30 个循环。 PCR 产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.8 ELISA 检测转染后细胞及传代后hFIX：Ag表达

依据实验分组,A 组细胞转染后72 h,B、C、D组待细胞长满细胞瓶,提取细胞上清液,依据ELISA试剂说明书,检测上清液中hFIX：Ag 表达情况。

1.2.9 Western Blot 检测转染后细胞及传代后目的蛋白表达

依据实验分组,A 组细胞转染后72 h,B、C、D组待细胞长满细胞瓶,提取细胞蛋白。 BCA 蛋白浓度测定后,行Western Blot 检测蛋白表达。

1.3 统计学分析

实验所得数据采用 SPSS 17.0 和 GraphPad Prism 5 软件处理统计分析软件进行分析,计量资料以平均值± 标准差(¯x ± s)表示,多组间数据进行单因素方差分析,P ＜0.05 表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 C57BL/6 小鼠ADSC 复苏后状态观察

如图1 所示,冻存ADSC 在细胞复苏后,大致外观与冻存前ADSC 未见明显改变,细胞呈均匀长梭型生长。

2.2 重组腺病毒 Ad-F9-GFP 转染小鼠ADSC 及转染后传代荧光图

重组腺病毒Ad-F9-GFP 转染 ADSC 24 h 后,荧光显微镜下可见荧光表达。 随时间延长荧光逐渐增强,72 h 后可见荧光亮度强于24 h。 待细胞长满细胞瓶,传代后仍可见荧光表达(图2)。

2.3 转染后ADSC 的成骨诱导检测

如图3 所示,A、B 两图为重组腺病毒转染细胞后成骨诱导,图C、图D 分别为第7 天、第30 天进行ALP 染色,图C 为应用偶氮偶联法,图中显示大量红色颗粒为细胞核,散在可见部分蓝色颗粒。 图D为第30 天行茜素红染色,细胞间可见大小不一的棕褐色块状沉淀,即矿化结节。

2.4 RT-PCR 检测转染后ADSC 传代后目的基因表达

如图 4 所示,四组细胞均可见到内参基因GAPDH 的表达,在 F9 基因表达上, A、B、C 组可见到符合118 bp 基因表达片段,而D 组未见到表达情况。 根据图像,进行灰度值分析,A、B、C 三组明显高于D 组表达,差异具有显著性。

2.5 ELISA 检测转染后细胞及传代后hFIX:Ag表达

结果分析显示四组细胞中,A 组、B 组及 C 组ELISA 法检测抗原水平,均可见hFIX：Ag 的表达,分析四组间数据,差异具有显著性。 A 组中hFIX：Ag(81.62 ± 8.82)ng/mL 水平明显高于其它三组,B 组(52.50 ± 3.25)ng/mL、C 组(47.41 ± 4.00)ng/mL hFIX：Ag 水平高于 D 组正常 ADSC(0.76 ± 0.44)ng/mL,提示ADSC 在转染重组腺病毒Ad-F9-GFP后传代2 次仍可稳定表达目的蛋白(图5)。

注：A：冻存前24 h;B：复苏后24 h;C：复苏后48 h;D：复苏后72 h。图1 复苏后ADSC 细胞生长情况Note. A,24 hours before cryopreservation. B,24 hours after recovery. C,48 hours after recovery. D,72 hours after recovery.Figure 1 Growth of ADSC cells after recovery

注：A：转染 24 h 后;B： 转染 72 h 后;C：转染后传代 1 次;D：转染后传代 2 次。图2 Ad-F9-GFP 转染细胞及传代后荧光表达Note. A, 24 hours after transfection. B, 72 hours after transfer. C, The first passage after transfer. D, The second passage after transfer.Figure 2 Fluorescent expression of Ad-F9-GFP transfected cells and subcultured cells

注：A：重组腺病毒转染后成骨诱导;B：重组腺病毒转染后成骨诱导荧光图;C：成骨诱导后碱性磷酸酶染色;D：成骨诱导后茜素红染色。图3 重组腺病毒转染ADSC 成骨诱导图Note.A, Osteogenic induction after recombinant adenoviral transfer. B, Osteogenic induction fluorescence map after recombinant adenoviral transfer. C, Alkaline phosphatase staining after osteogenic induction. D, Alizalin red staining after osteogenic induction.Figure 3 Results of osteogenic induction of ADSC by recombinant adenovirus

注：与 D 组相比,***P＜ 0.001。 (下图同)图4 四组细胞F9 基因RT-PCR 结果及灰度值比较图Note. Compared with group D,***P＜0.001.(The same in the following Figures)Figure 4 Comparison of RT-PCR results and gray value of F9 gene in the four groups

图5 ELISA 检测细胞上清液hFIX：Ag 表达水平Figure 5 Expression of hFIX：Ag in cell culture medium by ELISA

2.6 Western Blot 检测转染后细胞及传代后hFIX表达

如图6 所示,A 组蛋白表达灰度值(0.68 ±0.10)、B 组(0.49 ± 0.15)、C 组(0.18 ± 0.05)明显高于D 组蛋白表达灰度值(0.02 ± 0.01),差异具有显著性。

3 讨论

血友病B 为一种单基因隐性遗传性疾病,男性多发病,研究表明血友病发病率约为1/25 000[4],目前的治疗方法主要以替代治疗为主[5]。 然而,替代治疗具有一个非常常见的问题,即FIX 因子半衰期约为24 h,随着时间的延长,药物浓度逐渐降低,无法持久维持在有效血药浓度。 并且随着给药频率的增加,也将增加患者体内FIX 抗体即抑制物的发生率。 这种抑制物的产生则会使之后的凝血因子输注达不到预期效果[6]。 作为一种单基因遗传性疾病,基因治疗成为可能治愈手段成为可能。 基因治疗则可以分为体内途径(in vivo)和体外途径(ex vivo),in vivo 主要是指将携带有目的基因的各种载体直接注入体内,从而产生一系列的蛋白表达,达到研究者的预期结果。 而ex vivo 则主要表现在将目的基因整合到从机体内分离提取的各种干细胞上,再通过将该细胞移植到宿主体内,达到预期效果[7]。

图6 Western Blot 检测细胞hFIX 蛋白水平Figure 6 Western Blot was used to detect cellular hFIX protein expression

在各种间充质干细胞中,脂肪间充质干细胞(ADSC)具有其自身的优势,易于提取[8-10]。 研究表明,ADSC 仍具有其他间充质干细胞的主要特征：具有向其它细胞分化的潜能[11-19]。 多项研究表明,ADSC 的应用范围非常广泛,得到了众多方面的应用[20-29]。

在本研究前期工作中,对于 C57BL/6 小鼠ADSC 的分离培养有所涉及,并对于该细胞进行了流式细胞术及成脂成骨诱导分化培养进行鉴定,证明ADSC 的成功抽提。 同时通过将腺病毒和ADSC相结合,对于血友病基因治疗的体外方法成功奠定基础。 初步证明了携带hFIX 基因的腺病毒能有效转染ADSC,使其表达具有凝血活性的hFIX 蛋白。基于上述实验研究结果,本实验通过对于携带hFIX基因的腺病毒转染后的ADSC 传代培养,初步探讨携hFIX 基因重组腺病毒转染后的ADSC 是否稳定表达。

实验过程中,我们发现重组腺病毒转染ADSC后,经过传代后培养,仍可表达较高的hFIX 活性。ELISA 检测细胞上清液中,携带 F9 基因转染的ADSC 经过细胞传代培养仍可以分泌hFIX 并分泌如细胞上清液。 数据表明,三组实验组数据均明显高于空白对照组。 Weston Blot 检测四组ADSC 的细胞内蛋白表达,A、B、C 三组均可见到表达在50kDa左右的hFIX 蛋白表达,而D 组未见到该蛋白表达。在本实验中,应用RT-PCR 检测四组ADSC 中F9 基因表达情况,结果显示：A、B、C 三组均可见到位于118 bp 的基因表达条带而未见到D 组表达。 实验中,ELISA、Weston Blot 及 RT-PCR 结果中,A 组数值均为最高,考虑与腺病毒本身的特点,该病毒为非包膜双联DNA,携带的遗传物质并不整合到宿主细胞基因组有关。 但是该病毒包装量大,也避免了插入突变的风险[30]。

综合上述实验结果,我们初步认为在携带hFIX基因的腺病毒转染后的ADSC,其携带的hFIX 基因并不受细胞传代的影响。 ADSC 可以作为基因治疗的有效靶细胞。 这也为后续血友病ex vivo 基因治疗动物实验奠定了基础。