脂多糖诱导SD 大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞炎症模型建立及特征分析

熊 翱, 熊仁平,彭 艳, 李 宇, 江 旭,许建中*

(1. 郑州大学第一附属医院骨科,郑州450052;2. 中国人民解放军陆军特色医学中心野战外科研究部,重庆400042)

纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是关节滑膜的主要细胞之一[1]。 生理状态下的FLS 参与润滑和免疫调节功能,维持关节腔稳态,参与关节的正常功能[2];滑膜炎症状态下的FLS,由关节保护作用转变为关节破坏作用,分泌炎症介质,使滑膜免疫细胞浸润。 免疫细胞诱导滑膜纤维化和滑膜新生血管形成[3],加重FLS 的促炎状态,导致蛋白酶和促炎细胞因子增加[4],逐步导致关节功能丧失。所以,滑膜 FLS 在炎性关节病(inflammatory joint disease,IJD)中的作用研究越来越受到重视。 但要对FLS 进行深入研究,首先要解决的问题,是建立滑膜FLS 的原代培养及其病理模型。

有研究者通过手术时获取伤病患的关节滑膜分离原代培养滑膜细胞进行FLS 研究[5-6],但获取病人滑膜的影响因素多,为IJD 的FLS 研究增加了难度。 据此,有学者采用手术和化学法(木瓜蛋白酶、单碘乙酸钠和胶原酶等)诱导OA 模型[7],分离其滑膜FLS,偏重于骨关节退行性变的研究;有学者采用胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)[8],分离其滑膜 FLS,偏重于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的发病机制和治疗研究;有学者建立佐剂性关节炎大鼠滑膜成纤维细胞(AA-FLS)[9],偏重于类风湿药物研究,等等。 国内外学者从诱导的各类动物疾病模型中分离出的FLS,对FLS 的鉴定,绝大多数采用的是形态观察以及组织化学染色法和流式细胞术检测FLS 的蛋白标志物波形蛋白(Vimentin),只有极少数进行了FLS 的细胞增殖功能鉴定[6]。 但他们都没有进行原代培养的正常FLS 和诱导模型的FLS 特征蛋白检测和分析。

不论是OA,还是RA 和强制性脊椎炎等IJD,都要释放促炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等[10-11],并且这些炎症因子与信号通路之间存在级联反应,通过各种途径促使IJD 的发生发展。 促炎因子不仅参与炎症生成阶段的调节,且在随后的炎症消退中也发挥重要作用。 促炎因子已被确定为炎症的关键介质[11]。 鉴于此,若能诱导出FLS 的炎症模型,势必对 IJD 的抑炎研究提供了工具。 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌壁外壁的组成成分,是由脂质和多糖构成的物质。 当其作用于人类或动物等其他生物细胞时,就会表现出多种生物活性。 LPS 是动物免疫系统对入侵的革兰氏阴性菌的首要识别及攻击目标,它能够诱导动物分泌多种炎性细胞因子,如 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等,广泛用于动物疾病建模。 国内外学者,通过小鼠乳头乳导管灌注0.2 mg/mL 的LPS 50 μg 成功诱导小鼠乳腺炎模型[12],D-氨基半乳糖联合LPS 腹腔注射8 周,隔日1 次,成功诱导了小鼠慢性肝损伤模型[13]。 OA 和 RA 的研究中,LPS 制激上调了IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的蛋白水平[11,14]。 由此可见,LPS 制激FLS 可以模仿类似于OA 和RA 的炎症环境。 在IJD 体外研究中,用 LPS 诱导 FLS 炎症状态,建立FLS 炎症模型在理论上是可行的。

本研究通过分离SD 雄性大鼠的膝关节滑膜组织,原代培养至第 3 代,进行 FLS 蛋白标志物Vimentin 和增殖功能鉴定,同时,用滑膜组织作为对照,检测原代培养FLS 的特征蛋白的表达,筛选具有生理功能且纯度达95%的FLS,用LPS 进行FLS炎症模型诱导,检测其促炎细胞因子和特征蛋白的表达,建立FLS 炎症模型,为IJD 发病机制及其治疗研究提供实验工具。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

4 周龄 SPF(specific pathogen free animals)级雄性SD 大鼠45 只,体重约为100 g,购于陆军军医大学陆军特色医学中心实验动物中心【SCXK(军)2017-0026】,饲养于陆军军医大学陆军特色医学中心实验动物中心【SYXK(军)2017-0058】。 所有操作均符合陆军军医大学实验动物伦理学要求(审批号：AMUWEC20201267),严格按照实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。

1.1.2 仪器与试剂

显微外科手术器械(上海医疗器械有限公司),25 cm2培养瓶(Hyclone), 0.22 μm 滤器(millipore),CO2培 养 箱 (Thermo, 美 国), MillicellREZISLIDE(Millipore)。 戊巴比妥钠(德国进口分装),DMEM(high glucose)(BI), 双抗(GiBco), 0.25%胰酶(GiBco),4% 多聚甲醛(博士德),Anti-vimentin(Abcam, ab8978)。 Anti-mouse Alexa Fluor 488(Abcam,ab15017),DAPI(Abcam,ab228549),小鼠SP试剂盒(中杉金桥),DAB 染色试剂盒(中杉金桥)。Western Blot 实验系统和试剂(Bio Rad,美国)。

1.2 方法

1.2.1 滑膜细胞的获取与原代培养

采用腹腔注射1.5% 戊巴比妥钠麻醉SD 大鼠,剂量为2 mL/(kg·bw)。 75%乙醇浸泡大鼠10 ～20 min,取双侧后膝关节(图 1A、1B)。 先后用自来水和含双抗(100 μ/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin)的PBS 冲洗膝关节后,转移膝关节至超净工作台盛有含双抗的PBS 平皿中,进行滑膜组织分离。 分离条件：冰浴,无菌,PBS 浸泡,锐性。 剪碎滑膜组织至1mm × 1mm × 1mm,将其移至10 mL无菌离心管短暂低速离心, 弃上清,加入 1 mL 0.2% Ⅰ型胶原酶重悬滑膜组织,转移其至25 cm2培养瓶,用0.2% Ⅰ型胶原酶定容至3 mL,轻晃培养瓶,使其底部滑膜组织均匀分布。 在37℃和5%CO2下,消化滑膜组织4 ～6 h,使其变成棉絮状,向培养瓶加入10% FBS 终止消化。 收集滑膜组织转移至无菌离心管,短暂低速离心,弃上清,加入完全培养基重悬洗涤一次后,移至25 cm2培养瓶,用高糖完全培养基(含双抗)定容至3 mL,轻晃培养瓶,使滑膜组织在底部均匀分布。 在37℃,5% CO2的培养箱培养滑膜组织,每天观察细胞游出情况,第2 天可见梭形细胞游出(图1C),2 ～3 d 换液一次。

1.2.2 滑膜细胞传代

待原代培养细胞融合度达70% ～80%,吸弃培养基。 向培养瓶加入含EDTA-2Na 的0.25%胰酶消化,轻晃培养瓶,使消化液覆盖瓶底,轻拍瓶底,帮助消化。 倒置显微镜观察到细胞间隙增大,细胞回缩变圆且悬浮时,向培养瓶加入10% FBS 终止消化。 收集细胞至离心管,短暂低速离心。 完全培养基洗涤1 次,再用完全培养基重悬细胞,混匀,按1 ∶2～1 ∶3传代至新的无菌培养瓶中。

1.2.3 滑膜细胞鉴定

(1) 细胞形态观察

在倒置显微镜下,每天观察滑膜细胞的形态,生长状态。 梭形为FLS,圆形、椭圆形为巨噬样滑膜细胞。 观察每代梭形细胞占视野细胞中的比例,目测FLS 的纯度。

(2) 细胞免疫荧光化学染色

第3 代滑膜细胞,调整细胞比例为4 × 104/mL,按每孔0.2 mL 的容量接种至腹腔小室,培养箱培养24 h。 向腹腔小室加入 4%多聚甲醛 300 μL, 固定20 min 后,PBS 洗 2 ～ 3 次。 用 0.2% Triton X-100,在37℃下透化20 min 后,向腹腔小室加入鼠抗Vimentin 抗体(1 ∶200),4℃湿盒孵育过夜,加入荧光488 抗鼠 IgG(1 ∶500),在 37℃ 下 避光孵育 1 h 后,用DAPI 对细胞核染色(37℃)15 min 后,用防荧光淬灭剂封片。 荧光显微镜观察并拍照。 根据所测滑膜细胞中Vimentin 染色情况,判断FLS 的纯度。如滑膜细胞中染色Vimentin 的细胞在98%以上,即98% 以上的细胞为FLS。

(3) 细胞免疫组织化学染色

第3 代滑膜细胞参照细胞免疫荧光化学染色加入鼠抗Vimentin 单抗,下面步骤按小鼠SP 试剂盒说明书进行。 DAB 显色后显微镜下观察拍照分析。判断滑膜细胞FLS 纯度的方法同(2)。

(4) FLS 的EdU 细胞增殖检测

注：A：SD 正常大鼠。 B：膝骨关节滑膜分离。 C：滑膜细胞培养第 1 天(×10)。 D：滑膜细胞培养第 6 天第 1 代传代前(×10)。 E：滑膜细胞培养至第 3 代(× 10)。 F：滑膜细胞培养至第 8 代(× 10)。 G-M：滑膜细胞培养至第 3 代 Vimentin 荧光化学鉴定(× 40,标尺 = 25 μm)(G：Vimentin,绿色;L：DAPI,蓝色; M： Merge)。 N-P：滑膜细胞培养至第 3 代 Vimentin 组织化学鉴定(×40,标尺 = 50 μm)(N：Vimentin 为棕黄色,DAPI 缺失;O：DAPI 为蓝色,Vimentin 缺失;P：Vimentin 为棕黄色,DAPI 为蓝色即细胞核)。图1 SD 大鼠正常滑膜细胞原代培养及其鉴定Note. A, SD normal rats. B,Synovium of knee joint was separated. C,Synovial cells cultured on day 1(× 10). D,Synovial cells were cultured on the 6th day before the first passage(× 10). E, Synovial cell culture to the third generation. F, Synovial cell culture to the eighth generation(× 10). GM, Fluorescence identification of vimentin from synovial cell culture to the third generation (×40, bar = 25 μm)(G, Vimentin, green. L, DAPI,blue. M,Merge). N-P,Histochemical identification of vimentin from synovial cell culture to the third generation(× 40,bar = 50 μm)(N, Vimentin is brownish yellow, DAPI is absent. O, DAPI is blue, vimentin is absent. P, vimentin is brownish yellow, DAPI is blue, i.e. nucleus).Figure 1 Primary culture and identification of normal synovial cells of SD rats

参照EdU 细胞增殖检测(广州锐博生物科技有限公司,产品编号： C10310-1)说明书完成。 简述如下：第七代滑膜细胞,调整细胞比例为4 × 104/mL,按每孔0.2 mL 的容量接种至腹腔小室,培养箱培养24 h。 用细胞完全培养基按 1000 ∶1稀释 EdU 溶液,制备成 50 μmol/L EdU 培养基;每孔加入100 μL 50 μmol/L 培养基孵育12 h。 向腹腔小室加入含4%多聚甲醛的 PBS 300 μL 固定 30 min。 用 0.5% Triton X-100 渗透剂孵育 10 min 后,每孔加入 100 μL Apollo©染色反应液,脱色摇床孵育30 min。 用100 μL 0.5% Triton X-100 渗透剂脱色摇床清洗2 ～3次,每次 10 min。 在 37℃下,用 100 μL 1 × Hoechst 33342 对 DNA 避光染色 25 min,PBS 洗 2 ～ 3 次,用防荧光淬灭剂封片。 荧光显微镜观察并拍照。

1.2.4 LPS 制激 FLS

采用鉴定纯度超过98%的FLS,细胞比例为4 × 104/mL, 按每孔0.2 mL 容量接种至腹腔小室,培养箱培养24 h。 向腹腔小室加入LPS,使其终浓度为1000 ng/mL(经过预实验获得),制激FLS 细胞24 h。 在 0、1、3、6、12、24 h 的时间点,分别用0.25%的胰酶消化FLS 2 ～5 min,用10% FBS 终止消化,各收集细胞5 例,贮于-80℃备用。

1.2.5 Western Blot 测定FLS 中的细胞因子和特征蛋白表达

收集滑膜组织和培养对数生长期且纯度达到98%的第 3 ～ 8 代 FLS 及其经 1000 ng/mL LPS 制激不同时间观测点的细胞,各5 例,提取总蛋白。考马斯亮蓝法定量总蛋白,调整样品总蛋白终浓度为 1.5 mg/mL。 每孔上样 20 μL,SDS-PAGE 电泳分离。 0.3A 恒流湿转50 min 或1.5 h,将凝胶电泳分离后的蛋白质转移至PVDF 膜上。 转膜结束后,PVDF 膜置入6%脱脂奶粉封闭。 PVDF 膜经封闭洗膜后,加入兔抗 IL-1β、TNF-α、PCNA、Collagen IV、 Fibronectin、 VEGF、 Lubricin 和Hyaluronan Synthose 2 多抗,按 1 ∶1000 稀释。 使PVDF 膜与上面相应的一抗,在室温孵育50 min 或1.5 h。 再次洗膜后,加入辣根过氧化物酶标记的IgG(1 ∶10 000),使 PVDF 膜 与 之 在 室 温 孵 育50 min, ECL 法检测。 检测完毕,用 0.01 mol/L pH 7.2 的 PBS 洗涤 PVDF 膜 2 次 × 15 min,用抗体洗脱液(pierce 公司)洗脱PVDF 膜上抗体,1 次× 15 min,同上法洗膜和封闭后,用辣根过氧化物酶标记的甘油三磷酸脱氢酶(glycerol 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体(1 ∶10 000),与 PVDF在室温孵育50 min,ECL 法检测。 扫描分析软件系统扫描X 射线光片蛋白条带进行密度分析。 结果采用目的蛋白的光密度值与GAPDH 内参蛋白的光密度值比值校正上样量误差。

1.2.6 QRT-PCR 检测 IL-1β 和 TNF-α mRNA 基因变化

将用终浓度为1000 ng/mL 的LPS 制激FLS 后收集的细胞,采用TRIzol 法提取总RNA,promega 公司的反转录试剂合成 cDNA,用 IL-1β (Forward：5′-CCTTGTGCAAGTGTCTGAAG-3′; Reverse： 5′- GGG CTTGGAAGCAATCCTTA-3′)、TNF-α (Forward： 5’-CAAGGAGGAGAAGTTCCCA-3’;Reverse： 5’-TTGG TGGTTTGCTACGACG-3’)和 GAPDH (Forward： 5’-TCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3 ’; Reverse： 5 ’-TTCAGGTGAGCCCCAGCCTT-3’)引物[15]去扩增,分析 IL-1β 和 TNF-α mRNA 的表达。 复管,重复 5 次。qRT-PCR 反应体系：2 × master mix(promega 公司)10 μL, 消毒水 7 μL, primer 0.5 μL,cDNA 2 μL。 PCR条件：95℃,10 s 变性,PCR 优化的退火温度,59℃,15 s 退火,40 个循环。 55℃ to 95℃ 观察melt cure。

1.3 统计学分析

实验数据采用平均值± 标准差(¯x ± s)表示,两组间数据比较采用 t 检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t 检验。 以P ＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 滑膜细胞形态和生长情况

分离的滑膜组织经培养6 ～8 h 后,开始贴壁,1 d 后细胞游出,绝大部分为梭形(图1C),圆形、椭圆形较少。 培养第 6 天,细胞融合度达 70% ～80%,贴壁生长,但仍有极少的圆形、椭圆形细胞(图1D)。 培养第12 ～ 14 天,已传至第3 代的滑膜细胞形态基本上全为梭形,圆形、椭圆形等其他形状基本消失(图1E)。 第8 代滑膜细胞增长缓慢,形态从梭形变为近似椭圆形,细胞间隙增大(图1F)。 滑膜细 胞 第 3 ～ 7 代, 增 殖 活 跃, 生 长 情 况 良好(图1G-M)。

2.2 滑膜细胞的免疫荧光化学和免疫组织化学染色

I 型胶原酶消化法获得的滑膜细胞第3 代,用免疫染色观察：形态规则,呈梭形,其细胞核为卵圆形且位于细胞中央;滑膜细胞Vimentin 染色阳性率大于98%(图 1G-P)。 Vimentin 为 FLS 特征性标注蛋白,提示培养的滑膜细胞为FLS,且纯度达98%以上。

2.3 原代滑膜细胞的增值功能检测

对第7 代滑膜细胞的EdU 增殖实验,显示细胞具有增殖能力(图2A,B)。 通过对滑膜组织和第3 ～8 代各代滑膜细胞的增殖核抗原PCNA 蛋白的Western Blot 检测分析,各代培养细胞同滑膜组织一样,都有增殖功能。 与第3 代比较,除第8代 PCNA 蛋白表达下调(t = -51.056,**P ＜0.01),差异具有显著性外,余各代差异不具有显著性(图2C,D)。

2.4 滑膜组织和滑膜FLS 的细胞因子和特征蛋白检测

通过原代培养滑膜组织而获得的FLS,与滑膜组织一样,都能表达具有天然免疫应答的细胞因子和特征蛋白。 与第 3 代 FLS 的 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表达量比较,第 4 ～ 7 代的每代 FLS 的 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表达差异不显著,第 8 代 FLS 的 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表达下调,差异具有显著性(图3A-C)。 原代培养获得的FLS 具有分泌对关节囊有修复作用的结缔组织成分,与第3 代FLS 比较,第4 ～ 7 代的每代FLS分泌Collagen IV 和Fibronectin 蛋白水平差异不显著,第 8 代 FLS 分泌 Collagen IV 和 Fibronectin 蛋白的能力下降,差异显著(图4A-C)。 同时,原代培养获得的FLS 还有产生与滑膜组织一样的Lubricin 和Hyaluronan Synthose 2 蛋白的能力,与第 3 代 FLS 比较,第4 ～7 代的每代FLS 分泌功能没有显著差异,第8 代分泌功能减弱,差异显著(图4A、D 和 E)。 综合对原代培养滑膜细胞获得的FLS 的细胞因子和特征蛋白检测结果,确定滑膜细胞原代培养的第3 ～7代FLS 可作为后续实验研究。

2.5 LPS 制激 FLS 后不同时间点炎症因子的mRNA 和蛋白的表达

1000 ng/mL 的 LPS 制激 FLS 后,与 0 h 相比较,IL-1β 和 TNF-α mRNA 的表达迅即上升,在 3 h达到高峰,其均值是0 h 的17.865 倍和19.177 倍,随后下降,但仍高于 0 h(图 5A,B)。 同时,IL-1β 和TNF-α 在蛋白质上的表达,与0 h 相比较也迅即上调,在6 h 达到高峰,但与3 h 比较无显著差异,6 h的 IL-1β 和 TNF-α mRNA 蛋白表达与 GAPDH 内参蛋白表达的比值是1.003 和1.380,随后下降。 6 h后但仍高于0 h(图 5C,D)。 综合 LPS 制激 FLS 后的细胞因子IL-1β 和TNF-α 在基因和蛋白质上的表达情况,确定LPS 制激FLS 的时间为3 h,制激FLS的LPS 终浓度为1000 ng/mL,完成LPS 诱导FLS 的炎症模型。

2.6 LPS 制激FLS 后3 h 细胞因子和特征蛋白的表达

1000 ng/mL LPS 制激FLS 3 h,与制激前比较,细胞因子IL-1β 和 TNF-α 在蛋白质上上调显著,增殖核抗原PCNA 蛋白增加明显(图6A);Collagen IV和Lubricin 蛋白表达增加且差异显著,具有修复关节囊作用的结缔组织成分Fibronectin 蛋白明显下调(图 6B);Hyaluronan Synthose 2、VEGF 和 Cadherin蛋白表达增加且差异显著(图6C)。

3 讨论

建立实验动物的体内和体外模型,目的都是为了更好地研究疾病的发病机制、治疗方法及其效果评价,但动物的选择要根据实验需要和研究目的来确定,同时还要兼顾实验时间的长短、动物饲养成本的高低、操作难易程度等。 为了研究RA 的滑膜增生,陈芳等[16]改良了组织块法,分离培养了兔膝关节FLS。 滑膜炎症是 OA 和 RA 等 IJD 的共同病理过程,其动物模型,应选择动物成熟期短,能满足较短的实验周期,且生存及抗感染能力较强的动物。 据统计,目前1/4 OA 动物模型选择大鼠作为实验动物[17]。 大鼠模型能模拟人类IJD 发病机制和病理过程,且具有操作方便易行、稳定性高、干扰因素少等特性。 本实验不仅是建立滑膜FLS 原代培养方法,更重要的是建立FLS 炎症模型,所以我们选择了SPF 级SD 大鼠。 建模获得成功,为研究IJD 提供了良好的实验条件。

注：A：滑膜组织(ST)及其原代培养第 3 代 ～ 第 8 代 FLS 的 IL-1β、TNF-α 及其 GAPDH 的 Western Blot 结果。 B：各组 IL-1β 蛋白相对含量。组间单因素方差分析,F = 5.115,P = 0.002。 IL-1β 蛋白表达相对光密度值,与第3 代FLS 比较,第8 代FLS 降低非常显著(t = -5.639,**P＜0.01)。 ST、第4 代 ～ 第7 代FLS 变化差异不具有显著性。 C：各组TNF-α 蛋白相对含量。 组间单因素方差分析, F = 8.672,P ＜0.001。TNF-α 蛋白表达相对光密度值,与第3 代FLS 比较,第8 代 FLS 降低非常显著,**P ＜ 0.01。 ST、第4 代 ～ 第 7 代 FLS 变化差异不具有显著性。图3 滑膜组织和滑膜FLS 的细胞因子Western Blot 检测分析Note. A, Western Blot results of IL-1β, TNF-α and GAPDH in synovium tissue (ST) and primary synovium cells after passage. B, One-way ANOVA between IL-1β protein groups, F = 5.115, P = 0.002. Compared with the expression of IL-1β protein in the third generation FLS, the expression of IL-1β protein in the eighth generation FLS decreased significantly (t = -5.639,**P ＜ 0.01). There was no significant difference between the ST, the fourth generation to the seventh generation FLS and the third generation FLS. One way ANOVA between TNF-α protein groups,F = 8.672,P ＜ 0.001.Compared with the expression of TNF-α protein in the third generation FLS, the expression of TNF -α protein in the eighth generation FLS decreased significantly(**P ＜0.01). There was no significant difference between the ST, the fourth generation to the seventh generation FLS and the third generation FLS.Figure 3 Western Blot analysis of cytokines in synovial tissue and FLS

在OA 和RA 等IJD 中,由于可溶活性因子和细胞表面的相互作用激活FLS,合成并释放促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 等,激活免疫系统,从免疫防御转变为免疫破坏,破坏关节,改变关节正常功能[18]。越来越多的研究[19]显示：IJD 滑液促炎因子分泌增加,滑膜明显增厚,其FLS 异常增殖和侵袭。 IJD 中润滑素水平降低,透明质酸分子的数量下降,滑液的润滑能力也下降,增高了磷脂水平,脂肪链变短,不能有效减轻关节活动的摩擦力[20]。 促炎因子在炎症模型的高表达,是模拟炎症病理状态的关键。尤欣等[21]以hIL-1β 为炎症抗原诱导兔膝关节炎,检测到关节滑膜组织hIL-1β mRNA 的表达,滑膜组织呈结节样增生,关节炎的严重程度与注入关节腔的MFG hIL-1β 转染兔滑膜细胞数目成正相关。 熊乐等[22]向大鼠坐骨神经断端显微注射LPS(2 g/L)1 μL,术后 1.5 h 和 24 h 的 IL-1β mRNA 和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA 的表达明显升高。运用 LPS 诱导乳腺炎模型[12],导致 IL-1β、IL-6、TNF-α 等促炎因子释放异常增加,加重炎症。 LPS作为炎症抗原,LPS 激活了固有的免疫系统,可通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、FLS、上皮细胞等合成和释放多种细胞因子和炎性介质,具有良好的一致性和重复性[12]。 利用LPS 制激FLS 促进促炎因子的分泌,可以诱导出FLS 的炎症病理过程,LPS 诱导的FLS 炎症模型,符合IJD 的基本特征[20]。

注：A 和 B：显示用 2-△△CT表示 IL-1β 和 TNF-α mRNA 的相对表达含量。 单因素方差分析结果：IL-1β 的 F = 172.477,P ＜ 0.0001。 与 0 h比较,其余各观察时间点均**P ＜ 0.01,3 h 为其表达峰值(17.865 ± 1.754);TNF-α 的F = 162.478,P ＜ 0.0001。 与0 h 比较,其余各观察时间点均**P ＜ 0.01,3 h 为其表达峰值(19.177 ± 1.317)。 C 和 D：IL-1β 和 TNF-α 蛋白的相对表达含量。 单因素方差分析结果：IL-1β 的F = 28.694,P ＜0.0001,与0 h 比较,1 h 和24 h 观察时间点的P 值分别为0.057 和0.078,其余各观察时间点均**P ＜0.01,6 h 为其表达峰值(1.003 ± 0.096);TNF-α 的 F = 175.03,P ＜ 0.0001,与 0 h 比较,1 ～ 24h 观察时间点均**P ＜ 0.01,6 h 为其表达峰值(1.380 ±0.099)。图5 荧光qRT-PCR 法和Western Blot 法检测1000 ng/mL LPS 制激FLS 后不同时间点IL-1β 和TNF-α 的表达(n = 5)Note. A and B show the relative expression data of IL-1β and TNF-α mRNA with 2-△△CT. In statistical analysis, One-way ANOVA of IL-1β, F =172.477, P ＜ 0.0001, compared with 0 h,**P ＜ 0.01 at other observation time points, 3 h was its expression peak (17.865 ± 1.754); F =162.478, P ＜ 0.0001 of TNF-α. Compared with 0 h observation time point,P value of other observation time points were less than 0.01,3 h was its expression peak (19.177 ± 1.317) . C and D showed the Western Blot analysis of IL-1β and TNF-α protein. One-way ANOVA of IL-1β, F = 28.694, P ＜0.0001. Compared with 0 h, P value of 1 h and 24 h observation time points were 0.057 and 0.078, respectively. P value of other observation time points were less than 0.01,6 h was its expression peak (1.003 ± 0096)(C) . One-way ANOVA of TNF-α protein,F = 175.03,P＜ 0.0001. Compared with 0 h,**P ＜ 0.01 at 1-24 h, and the peak value was (1.380 ± 0.099) at 6 h (D).Figure 5 Detection of IL-1β and TNF-α expression at different time points after FLS stimulation with 1000 ng/mL LPS by fluorescence QRT- PCR and Western Blot (n = 5)

IJD 的主要特征是促炎因子 IL-1β、IL-6、TNF-α高表达,通过一系列炎症级联反应和激活各类信号通路,调节下游因子,促使 IJD 的发生和加剧,直至关节破坏。 IJD 的临床症状是关节疼痛、僵硬和关节残废[14]。 软骨降解在IJD 的发病中起着重要作用,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路是软骨降解的主要途径。促炎因子是激活p38-MAPK 信号通路的主要因素之一,MAPK 信号通路的异常激活又可促进炎症反应,导致软骨基质降解酶的释放,从而加速软骨退化[23]。 体外 FLS 炎症模型的建立,对 MAPK 信号通路研究提供了工具。 IL-1β 是IJD 首要致病因子之一,其可通过制激产生磷酸化的p38-MAPK 来合成大量NO,反馈激活 MAPK 通路,促进 IL-1β 的产生,增加前列腺素E2 及环氧化酶-2(COX-2)的水平,引起软骨损伤。 TNF-α 可介导多种炎症因子,可以与p38-MAPK 形成正反馈环路,活化的 p38-MAPK 通路可促进 TNF-α 的表达,过度表达 TNF-α可诱导软骨细胞凋亡。 这些促炎因子通过各种途径激活信号通路,促使 IJD 的发生发展。 NF-κB 信号通路影响着OA、RA 等IJD 炎症反应的各个阶段。NF-κB 信号通路参与血管内皮细胞黏附分子的表达并且与KOA 患者淤血状态密切相关。 淤血和患处新生毛细血管是关节疼痛的重要因素。 NF-κB 信号通路也是软骨降解进程中的关键分子途径,其通过促进 MMP-1、MMP-2、MMP-3 等多种降解酶的分泌及COX-2、NO 等分解代谢因子的合成,加剧关节炎软骨的凋亡和软骨的炎症反应[24]。 TNF-α 对FLS 的增殖有促进作用,可使滑膜组织纤维样变并增加滑液中的炎症因子,加重病情。 FLS 还具有类似肿瘤细胞增殖的特性,可突破生理屏障侵入软骨和骨,导致关节破坏。 FLS 入侵体参与FLS 与软骨的附着,其内富含基质金属蛋白酶,可特异性地使细胞外基质变性[25]。 LPS 既是炎症抗原,又是NF-κB 的激动剂,运用 LPS 诱导体外FLS 炎症模型的建立,有利于进行信号通路的干预,探讨如何降低IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF 和 MMP 等蛋白的表达,从而减弱或抑制住IJD 诱导的疼痛和炎症,延缓或阻止关节退变,达到治疗的目的。

注：A：1000 ng/mL LPS 制激FLS 3 h,与制激前比较,IL-1β 蛋白相对表达量升高,t = -6.817,**P ＜0.01;TNF-α 蛋白相对表达量升高 ,t =-11.443,**P ＜0.01;PCNA 蛋白相对表达量上调,t =-17.801,**P ＜0.01。 B：1000 ng/mL LPS 制激 FLS 3 h,与制激前比较,Collagen IV蛋白相对表达量上调,t = -6.702,**P ＜0.01;Lubricin 蛋白相对表达量升高,t = -5.686,**P ＜0.01;Fibronectin 蛋白相对表达量下调,t= 2.518,*P ＜0.05。C：1000 ng/mL LPS 制激FLS 3 h,与制激前比较,Hyaluronan Synthose 2(HYS2)蛋白相对表达量升高,t = -4.364,**P＜0.01;VEGF 蛋白相对表达量上调,t = -16.668,**P ＜0.01;Cadherin 蛋白相对表达量上调,t = -7.637,**P ＜0.01。图6 Western Blot 法检测1000 ng/mL LPS 诱导FLS 后3 h 细胞因子和特征蛋白的表达Note. A, 1000 ng/mL LPS stimulated FLS for 3 h, compared with that before stimulation,the relative expression of IL-1β protein was increased,t =-6.817,**P ＜ 0.01; the relative expression of TNF-α protein was increased, t = -11.443,**P ＜ 0.01; the relative expression of PCNA protein was increased, t = -17.801,**P ＜0.01. B, 1000 ng/mL LPS stimulated FLS for 3 h, compared with that before stimulation, the relative expression of collagen IV protein was increased, t = -6.702,**P ＜ 0.01; the relative expression of lubricin protein increased, t = - 5.686,**P ＜0.01; the relative expression of fibronectin protein decreased, t = 2.518,*P ＜0.05. C, 1000 ng/mL LPS stimulated FLS for 3 h, compared with that before stimulation, the relative expression of hyaluronan synthose 2 (HYS2) protein increased,t = -4.364,**P ＜0.01;the relative expression of VEGF protein increased, t = -16.668,**P ＜ 0.01; the relative expression of cadherin protein was up-regulated, t = -7.637,**P ＜ 0.01.Figure 6 Detection of the expression of cytokines and characteristic proteins in 3 hours after FLS stimulation with 1000 ng/mL LPS by Western Blot

综上所述,本研究建立的SD 大鼠正常膝关节滑膜FLS 原代培养方法,FLS 纯度高,成本低,来源容易,重现性好,操作简单,实验时间可控。 关键是第3 ～7 代FLS 具有宿主骨关节滑膜组织中的FLS的生理功能,且能分泌具有关节囊修复作用的结缔组织成分,还能合成透明质酸和润滑素等保证关节内环境的稳定的物质。 LPS 能诱导原代培养的滑膜组织FLS 分泌促炎细胞因子和诱导IJD 特征蛋白的表达改变,复制出IJD 的基本特征。 总之,LPS 诱导的FLS 炎症模型可作为体外研究IJD 的细胞模型。