电针对炎性痛大鼠背根神经节卫星胶质细胞活化和P2X7 受体表达的干预

周游,汪雯,蔡杨乾,杜俊英,邵晓梅,蒋永亮,刘伯一,高宏,梁宜,,方剑乔,2

(1. 浙江中医药大学第三临床医学院针灸神经生物学实验室浙江省针灸神经病学重点实验室,杭州 310053; 2. 浙江中医药大学附属第三医院针灸科, 杭州 310053)

随着生活水平的不断提升,人们对生活质量的要求日益提高,而慢性疼痛是损害患者生活质量的重要因素之一。 有报道显示：去年,发达国家中的慢性疼痛患者人数达到人口总数的37.3%,而发展中国家则高达41.1%[1]。 最新报道显示美国慢性疼痛的发病率高达4.8%[2],中国流行病学研究结果显示女性慢性疼痛发生率高于男性(女性：39.92%,男性：32.17%)[3]。 慢性疼痛严重影响患者的生活质量,给个人和社会造成巨大负担。 炎性疼痛是慢性疼痛的主要类型之一,目前主要采用非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)进行治疗[4]。 虽然 NSAIDs 抗炎镇痛疗效显著,但因胃肠道损伤、心血管损害等副作用而限制其临床应用。 电针疗法作为新型针刺疗法,因其镇痛疗效确切被广泛应用于临床镇痛[5]。

嘌呤 P2X7 受体(purinergic P2X7 receptor,P2X7R)是三磷酸腺苷敏感的配体门控阳离子通道的受体,在外周选择性表达于卫星胶质细胞[6-7],新近研究表明P2X7R 在疼痛信号传导中起重要作用[8-11]。 课题组前期研究已证实电针有较好抗炎镇痛效应[12-14],电针抗炎性痛效应是否与抑制外周卫星胶质细胞活化及其P2X7R 表达相关,暂未见相关报道。 故本研究通过观察电针对炎性痛大鼠背根神经节卫星胶质细胞活化与P2X7R 表达的干预,以期揭示电针抗炎性痛的部分外周调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级健康雄性 SD 大鼠 86 只,6 周龄,体重(180 ± 20) g,购自中国科学院上海实验动物中心【SCXK(沪)2018 - 0006】,由浙江中医药大学实验动物中心饲养【SYXK(浙)2018-0012】,本实验饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料(由浙江中医药大学实验动物中心提供)及自由饮水,12 h 循环灯光,恒定湿度,室温(23 ± 2)℃。 本实验所有操作均符合浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会实验伦理学要求,伦理审批号： IACUC-20190715-03。

1.1.2 试剂与仪器

完全弗氏佐剂(F5881,美国 Sigma),兔抗P2X7R(APR-004,美国 Alomone),GAPDH(3683,美国CST),兔抗GFAP(ab7260,美国Abcam),山羊抗兔IgG H&L(ab6721,美国 Abcam),P2X7R 选择性抑制剂A740003(3701,美国Tocris),P2X7R 选择性激动剂 BzATP(B6396,美国 Sigma),BCA 试剂盒(P0010,中国碧云天),ECL 试剂盒(P0018,中国碧云天)。

纤毛机械刺激针(NC12775, 美国 Stoelting Co.);韩氏穴位神经刺激仪(HANS-200 A,中国联创科技公司);一次性无菌针灸针(0.25 × 13 mm,中国苏州医疗用品厂有限公司);恒温手术台(美国Harvard);动物麻醉机(WMR,美国 MATRX);超声波粉碎机(中国宁波新芝生物科技有限公司);电泳-转印系统(美国BioRad);台式高速冷冻离心机(Sorvall Biofuge Stratos,美国 Thermo Scientific);酶标仪(SpectraMax M4,美国Molecular Devices);凝胶成像系统(Image Quant LAS4000,德国GE)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模

每只大鼠右后足掌面正中皮下注射完全弗氏佐剂(complete freud’s adjuvant,CFA)0.1 mL,建立大鼠炎性痛模型;对照大鼠仅在相同位置注射相同剂量的0.9%生理盐水溶液。

1.2.2 鞘内置管术

使实验第二部分大鼠适应环境3 d 后,于模前8 d进行鞘内置管术。 具体方法如下：采用异氟烷(输出浓度为2%)以500 mL/min 氧气流量进行低流量吸入麻醉。 将大鼠背部L6-S1 区域常规去毛备皮。 于大鼠L6-S1 棘突中间纵向做切口,分离肌肉与棘间韧带,用咬骨钳去除L6 部分棘突,形成“V”形切口,暴露椎间隙。 用导引针头刺穿硬脊膜,随后将PE-10 导管从穿刺部位斜向上缓慢插入,使其到达L4-L5 间隙。 经皮下隧道将导管另一端于颈部引出,前端保留4 ～6 cm,热熔封闭管的外端口。 置管术后肌肉注射青霉素并单笼饲养。 术后待大鼠活动自如后,注入10 μL 的2%利多卡因及25 μL 生理盐水。 鞘内注射后30 s 内大鼠出现双下肢麻痹,拖地、不能负重,钳夹或针刺不产生缩足反应,待药效消退后可完全恢复正常肢体活动能力,以此验证鞘内置管成功,否则为失败。

1.2.3 分组与处理

第一部分：48 只大鼠完全随机分为4 组：空白组(Con 组,n=12)、炎性痛组(CFA 组,n=12)、炎性痛 + 电针组(CFA + EA 组,n=12)、炎性痛+假电针组(CFA + sEA 组,n=12)。 除了 Con 组,余三组大鼠均接受造模和与CFA + EA 组相同固定处理。CFA + EA 组于造模后第8 天介入电针治疗,采用0.25 mm × 13 mm 针灸针刺入大鼠双侧“足三里”、“昆仑”,连接HANS-200 A 韩氏电针仪,刺激参数选用疏密波、频率2/100 Hz、强度为0.5-1-1.5 mA(每10 min 步进0.5 mA),每次治疗30 min,每日1次,连续7 d;CFA + sEA 组仅将针灸针刺入相同穴位皮下不予通电。

第二部分：鞘内置管术成功的38 只大鼠随机分为炎性痛 + DMSO 组(CFA + DMSO 组,n=8)、炎性痛 + A740003 组(CFA + A740003 组,n=10)、炎性痛+电针+生理盐水组(CFA + EA + NS 组,n=8)和炎性痛+电针 + BzATP 组(CFA + EA + BzATP 组,n=12),于造模后第12 ～14 天分别鞘内注射10 μL不同药物(0.1% DMSO 溶液、250 nmol/L A740003溶液、灭菌生理盐水和280 nmol/L BzATP 溶液),每日1 次,连续 3 d。 考虑到留置 PE 管体积,每次鞘内给药后给予25 μL 灭菌生理盐水冲管后再行封管。 CFA + EA + NS 组和 CFA + EA + BzATP 组鞘内给药前给予电针治疗,具体参数同第一部分,共治疗7 次。

1.2.4 痛行为检测

采用缩腿阈(paw withdrawal threshold,PWT)作为大鼠痛行为观测指标,分别于CFA 造模前后、电针治疗和鞘内给药前后不同时间点检测PWT。 正式测定前将大鼠置于铁丝网上的透明有机玻璃箱内(20 cm × 20 cm × 15 cm),使其适应环境 30 min。待大鼠停止梳理毛发和探索性活动,选用不同Von Frey 丝(0.4、0.6、1、2、4、6、8、15、26 g)垂直刺激大鼠右后足底中部,向大鼠足垫施加压力至Von Frey丝轻微弯曲并持续5 s。 若大鼠出现缩腿或舔足反应则为阳性反应,记为“X”并给予相邻小一级力度的刺激。 当该力度的von Frey 纤维刺激不能引起阳性反应时,则记为“O”并给予相邻大一级力度的纤维刺激,每次刺激间隔30 s。 由此可得到一串以“O”或“X”组合的序列,并使用 Chaplan 等[15]描述的方法进行计算。 若计算得出50% PWTs ＞26.0 g或＜0.4 g,仍以26.0 g 或0.4 g 作为最大或最小值。

1.2.5 取材及样本处理

本实验于CFA 模后14 d 检测完PWT 后,进行取材。 用3%戊巴比妥钠(0.15 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,暴露心脏,左心室、升主动脉用 4℃预冷的生理盐水快速灌注,快速取出患侧L4-6 DRG,置入-80℃冰箱中保存。

1.2.6 免疫印迹法检测大鼠DRG 中GFAP、P2X7R蛋白表达

将大鼠患侧L4-6 背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)使用 RIPA 裂解液提取总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度后,进行蛋白变性。 上样时采用8%分离胶、5%浓缩胶制胶,电泳后转印致PVDF 膜。 使用5% 脱脂奶粉封闭,分别用 TBST稀释好的一抗：兔抗 P2X7R(1 ∶1000,Alomone),兔抗 GFAP (1 ∶2000,Abcam),GAPDH(1 ∶1000,CST),4℃孵育过夜。 随后加入TBST 稀释的二抗：山羊抗兔IgG H&L(1 ∶10000,Abcam),室温搅动孵育2 h。 使用ECL 发光试剂盒显色拍片。 采用德国GE 公司凝胶成像系统ImageQuant LAS 4000 进行成像,拍片后使用Image J 软件计算条带的平均灰度值。

1.3 统计学分析

实验数据以平均值± 标准误( ¯x ± s¯x)表示,采用SPSS 21.0 软件进行统计分析。 两组组间采用独立样本t 检验,多组间比较采用单因素方差分析,多组间不同时间点采用双因素重复测量方差分析。两两比较方差齐性时采用LSD 检验、方差不齐时采用 Dunnett’s T3 检验;均以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠PWTs 变化

如图1 所示,造模前各组大鼠患侧基础PWTs无差异(P＞0.05)。 与Con 组比较,余三组大鼠造模后 1、3、7 d 时 PWTs 显著降低(P＜ 0.01);模后第8 天介入电针治疗,每次电针治疗后30 min 内完成PWTs 测量。 单次电针治疗后,CFA + EA 组大鼠患侧PWTs 并未出现显著变化(P＞0.05)。 电针治疗3、5、7 次后,CFA + EA 组大鼠患侧 PWTs 逐渐递增,显著高于同期CFA 和CFA + sEA 组(P＜0.05或P＜0.01),但仍低于同期Con 组(P＜0.01)。 结果提示重复电针治疗可有效缓解CFA 诱发的慢性炎性痛。

2.2 各组大鼠L4-6 DRG 中GFAP 蛋白表达变化

如图2 所示,造模后14 d 时,CFA 大鼠患侧L4-6 DRG 中GFAP 蛋白表达显著高于同期Con 组(P＜0.05);CFA + EA 组大鼠患侧 L4-6 DRG 中GFAP 蛋白表达显著低于同期CFA 组和CFA + sEA(P＜0.05),与同期Con 组无明显差异(P＞0.05);而CFA + sEA 组与同期CFA 组比较无显著差异(P＞0.05)。 结果表明电针可显著降低CFA 大鼠患侧DRG 中GFAP 蛋白表达,提示电针可抑制外周卫星胶质细胞活化。

2.3 各组大鼠 L4-6 DRG 中 P2X7R 蛋白表达变化

如图3 所示,于造模后14 d,CFA 组大鼠患侧L4-6 DRG 中P2X7 蛋白表达显著高于同期Con 组(P＜ 0.05);与同期CFA 组比较,CFA + sEA 组大鼠患侧 DRG 中 P2X7 蛋白表达无明显差异(P ＞0.05);CFA + EA 组大鼠患侧DRG 中P2X7 蛋白表达显著低于同期 CFA 和 CFA + sEA 组(均 P ＜0.05)。 结果表明电针可显著抑制CFA 大鼠患侧DRG 中 P2X7R 表达。

2.4 鞘内注射P2X7R 选择性抑制剂A740003 提高炎性痛大鼠机械痛阈

如图4 所示,实验大鼠接受鞘内置管术后予以修复1 周,分别于模前8 d、模前1 d 检测两组大鼠基础PWTs 情况,两组间无明显差异(P ＞0.05)。两组大鼠经由相同造模处理,模后两组痛阈均无差异(P＞0.05)。 实验大鼠于造模后12 ～14 d 分别鞘内注射A740003 或等量0.1% DMSO 溶液,CFA +A740003 组大鼠患侧 PWTs 显著高于同期 CFA+DMSO 组(均P＜0.01)。 结果提示鞘内给药P2X7R选择性抑制剂可拮抗CFA 大鼠痛觉异常。

2.5 鞘内注射P2X7R 激动剂BzATP 翻转电针抗炎性痛效应

如图5 所示,实验大鼠接受鞘内置管术后予以修复1 周,分别于模前8 d、模前1 d 检测两组大鼠基础PWTs 情况,两组间无明显差异(P ＞0.05)。两组大鼠经由相同造模处理,模后两组痛阈均无差异(P＞0.05)。 两组大鼠于造模后8 ～11 d 均接收电针治疗,组间无差异(P＞0.05);于造模后12 ～14 d 各时点,CFA + EA + BzATP 组大鼠患侧足跖PWTs 显著低于同期 CFA + EA + NS 组(均 P ＜0.01)。 结果提示鞘内注射 P2X7R 激动剂 BzATP可翻转EA 对CFA 大鼠的镇痛效应。

图2 各组大鼠L4-6 DRG 中GFAP 蛋白表达变化Figure 2 Changes of GFAP protein expression in L4-6 DRG among groups of rats

图3 各组大鼠L4-6 DRG 中P2X7R 蛋白表达变化Figure 3 Changes of P2X7R protein expression in L4-6 DRG among groups of rats

注：A： 实验流程图;B： 与 CFA+DMSO 组比较,*P＜ 0.05,**P＜ 0.01。图4 鞘内给药P2X7R 抑制剂A740003 提高CFA 大鼠患侧PWTsNote. A, Illustration of experimental design. B, Compared with CFA + DMSO group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 4 Intrathecal injection of selective P2X7R inhibitor A740003 increased ipsilateral PWTs of CFA rats

注：A：本实验流程及PWTs 测量时点示意图。 B：与CFA + EA + NS 组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。图5 鞘内给药P2X7R 激动剂BzATP 翻转电针对CFA 大鼠的镇痛效应Note. A, Experiment process and timing of PWTs measurement. B, Compared with CFA + EA + NS group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 5 Intrathecal injection of selective P2X7R agonist BzATP reversed EA’s analgesia on CFA rats

3 讨论

电针疗法是传统针刺疗法与微量电流刺激相结合的一种新型疗法。 最早于二十世纪五十年代由朱玉龙医生首次提出,用于替代临床针灸医师繁琐的运针过程。 现代研究表明,电针是临床镇痛的常用针灸方法,具有绿色、副作用小,临床上易于推广等优点,广泛用于治疗炎性痛、神经病理性疼痛等各类疼痛。 有临床观察研究结果表明电针镇痛取穴双侧肢体较单侧(患侧)疗效显著[16]。 课题组既往实验研究结果也表明,双侧电针穴位“昆仑”、“足三里”能有效缓解大鼠炎性痛[17]。 既往研究表明,CFA 致炎性痛大鼠模型于造模后4 ～24 h 处于急性期,1 ～3 d 处于亚急性期,3 d 后转向慢性痛[18]。 本研究前期实验表明,CFA 致炎性痛模型于模后1 d 出现患侧PWTs 显著下降,并持续维持较低痛阈至模后42 d。 模后28 d,对侧PWTs 显著降低,出现“镜像痛”并维持至模后42 d。 同时,热痛(thermal withdrawal latency,TWL)在模后1 d 显著下降并持续至14 d。 现有研究表明,通过在足底内注射CFA100 μL 可引起大鼠双侧机械性异常性疼痛,及患侧热痛觉过敏。 CFA 致炎性痛患侧PWTs 在模后(＜1 h)迅速下降,在模后7 d 到达最低峰值,并持续维持较低痛阈至造模后28 d。 约在模后28 d,对侧足跖也出现PWTs 降低的情况。 同时,CFA 致炎性痛也可引起 TWL 迅速下降(＜1 h)。 TWL 在模后6 h 达到峰值,于模后14 ～28 d 可缓慢恢复致正常水平[18-19]。 本研究中机械痛、热痛变化趋势与现有文献一致[18-19],说明造模成功。 Gao 等[19]通过鞘内注射选择性JNK 抑制剂,发现可降低CFA 致慢性炎性痛维持阶段的机械痛,但对其引起的热痛没有影响。 Lao 等[20]也指出,腹腔注射纳洛酮(20 mg/kg)可逆转单次电针对CFA 致炎性痛产生的机械痛阈下降。 以上结果提示两者(热痛与机械痛)机制有所差别,在慢性炎性痛的维持阶段,机械痛变化较之热痛更具变化特点。 由于本研究处于慢性炎性痛维持期,因此侧重机械痛的变化情况作为行为学测定标准。 据研究表明,电针对CFA 致炎性痛大鼠患侧PWTs、TWL 均具有升高作用[21-22],并且电针治疗在辣椒素、角叉菜胶及CFA 等不同药物诱导的炎性痛模型均有效果[23]。 这与实验室前期结果[24-25]相一致,提示电针治疗炎性痛效果确切。本研究中观察到连续7 d 电针治疗可升高CFA 致炎性痛大鼠患侧PWTs 至模后14 d,提示电针可以有效对抗炎性疼痛,与课题组以往研究结果相符[17,23-24]。 但本研究并未观察到单次电针的镇痛效应,可能与炎性痛大鼠在足底注射CFA 后24 h 时足部肿胀严重,导致大鼠缩足反应性降低所致,提示重复电针可有效缓解慢性炎性痛,而在炎性痛急性期治疗并不占优势。

背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)是初级感觉神经元的聚集地,负责将外周感觉信号传输至中枢神经系统;外周损伤引起的DRG 神经元胞体诱发出持续性的自发异位放电,常被认为传入脊髓后可增强外周信号和激发放大效应[25]。 卫星胶质细胞(satellite glial cells,SGCs)分布在DRG 神经元胞体周围,SGCs 活化可调控DRG 神经元兴奋性参与外周痛觉敏化的调控。 胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)被认为是中枢星型胶质细胞和外周卫星胶质细胞活化的特异性标志物。炎症、神经损伤等病理状态下SGCs 可被激活,主要表现为GFAP 表达增加[26-27]。 本研究观察到CFA大鼠造模后14 d 患侧L4-6 DRG 中GFAP 表达显著增高。 以往研究中在不同疼痛模型的不同时点也观察到与本研究类似结果。 Liu 等[28]在脊神经结扎(SNL)致神经病理性疼痛模型中,观察到SNL 大鼠于术后4 h 便观察到DRG 中GFAP 表达增加,并持续高水平表达至术后7 d。 Nascimento 等[29]研究表明,在CFA 致炎性痛模型中背根神经节GFAP 表达显著升高,造模后7 d 到达表达高峰并维持高水平至实验结束。 课题组以往研究结果显示,电针可抑制SNL 大鼠脊髓背角GFAP 表达,提示电针镇痛与其抑制星形胶质细胞密切相关[13]。 本研究中,我们观察到电针可显著抑制大鼠足底注射CFA 引起的DRG 中GFAP 表达升高,提示背根神经节 SGCs 活化参与CFA 诱发炎性痛,抑制SGCs 活化介导电针抗大鼠炎性痛效应。

近来研究表明,P2X7 受体在疼痛的发展和维持中担当重要角色,在炎性痛、神经病理性疼痛等多种疼痛状态呈表达上调[8-11]。 已有研究证实SGCs 活化与P2X7R 表达增加成正相关,GFAP 与P2X7R 蛋白表达在CCI 模型导致的神经病理性疼痛状态下均有升高趋势[30];Wu 等[31]发现在gp120诱导的神经病理性疼痛中大鼠DRG 内P2X7R 和GFAP 的荧光共表达增加。 在外周神经组织中,嘌呤P2X7 受体特异性表达于SGCs 中,背根神经元和SGCs 可以通过ATP 释放和P2X7R 激活进行细胞间通信。 以往有研究发现CFA 大鼠DRG 中P2X7R蛋白表达显著升高;敲除P2X7R 基因可消除炎症诱发的痛觉过敏;于大鼠足跖局部注射P2X7R 非特异性拮抗剂 oxidized ATP (ox ATP) 或鞘内注射A740003 可有效缓解不同造模方式导致的炎性疼痛[32-33]。 本研究结果也观察到CFA 大鼠患侧DRG中P2X7R 蛋白表达显著升高,且鞘内注射P2X7R拮抗剂A740003 可有效提高CFA 大鼠缩腿阈进而缓解炎性疼痛,与以往研究结果较一致[32-33]。 关于EA 是否通过调控P2X7R 表达发挥镇痛作用相关研究并不多见,主要集中于EA 对中枢脊髓P2X7R 表达的干预研究。 以往研究表明,EA 可通过抑制脊髓P2X7R 阳性小胶质细胞活化进而缓解神经损伤诱发的痛觉过敏[34];在颈部术后切口痛模型中,电针可通过抑制颈髓P2X7R 介导fractalkine/CX3CR1信号通路活化发挥镇痛效应[35]。 然而,抑制外周P2X7R 表达是否参与电针镇痛的相关性研究,尚未见相关报道。 本研究观察到电针可以显著抑制CFA 大鼠患侧DRG 中P2X7R 蛋白表达,且鞘内注射P2X7R 特异性激动剂BzATP 可有效翻转电针镇痛效应,结果提示外周P2X7R 参与电针抗炎性痛效应。

综上所述,电针可有效缓解大鼠慢性炎性痛,抑制外周SGCs 及其P2X7R 活化可能是电针抗炎性痛的外周作用机制之一。