几种抗高血压药物对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞IL-6、IL-17、IL-22 及IFN-γ 等细胞因子影响的研究

徐珂

（开封市人民医院检验科，河南 开封475000）

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，影响关节、结缔组织、肌肉及纤维组织，还可引起骨和软骨的变形[1]。 Th1/Th17 细胞介导的炎症反应是RA 的重要发病机制，细胞因子TNF、IL-6、IL-17 等是RA 发病的关键成分。 心血管疾病是RA 患者最常见的并发症之一, 它使RA 的死亡率增加了两倍[2]，RA 患者中系统性动脉高压（SAH）的患病率高达53%~73%, 而一般人群中不超过23%[3]。 最近的研究突出了炎症在高血压发展中的作用，先天性免疫、效应性和调节性T 细胞及共刺激分子与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)相互作用，参与高血压的发生[4]。

对RA 合并症的治疗，如SAH，优选血管紧张素转换酶抑制剂和/或血管紧张素II 受体阻断剂[5]。在对实验性自身免疫性心肌炎大鼠的研究中,缬沙坦可抑制Th1 相关的细胞因子水平并显著正向调节Th2 相关细胞因子, 证明缬沙坦可以作为Th细胞亚群平衡的调节剂[6]，另一方面，氯沙坦在心血管疾病患者中能够降低IL-6 的水平和增加TGF-β 的产生[7]。 还有些研究发现，依那普利是一种弱免疫调节剂[8]。显然这些药物除了控制血压外,还有不同程度的免疫调节作用，但它们对RA 患者外周血单个核细胞的作用尚不清楚。 本研究旨在探讨氯沙坦、依那普利和缬沙坦对RA 患者外周血单个核细胞产生的细胞因子IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17 和IL-22 的影响，并探讨其与疾病活动性的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取开封市人民医院于2017 年1月至2018 年1 月收治的RA 患者20 例,均符合20 10 年美国风湿病学会RA 的分类标准[9]，所有入选病例排除其他风湿性疾病、心血管、内分泌、甲状腺、免疫调节性疾病和癌症,收集患者的临床资料，见表1。 根据患者疾病活动评分（DAS28）评价患者疾病的活动度。DAS28<3.2 为低度活动，3.2~5.1 为中度活动,>5.1 为高度活动。 研究对象知情同意并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-22 检测ELISA 试剂盒购自默沙克生物科技有限公司。Ficoll-Hypaque 和抗CD3、抗CD28 单克隆抗体购自上海前尘生物科技有限公司。

1.3 检测方法 无菌条件下抽取患者空腹静脉血30ml，除了常规的血常规、类风湿因子、血沉等检测外，还做以下实验。

将RA 患者的外周血在无菌条件下,用Ficoll-Hypaque 密度梯度离心分离,磷酸缓冲液洗涤2 次,计数后调整浓度为1×106/ml 接种于6 孔板， 每孔1ml。 设不加抗体的细胞为空白对照,用抗CD3 和抗CD28 单抗刺激细胞，刺激后不加药物的为刺激组，刺激后加100μm 甲基强的松龙为阳性对照，实验组分别加入100μm 氯沙坦、缬沙坦和依那普利,每组设3 个复孔。 各组细胞在培养箱中培养48h，收集上清液放于-80℃冰箱储存。

酶联免疫吸附实验（ELISA）测定培养上清中的细胞因子,根据试剂盒说明书指示测定上清液中的细胞因子浓度。 IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-22 的 最 低 检 测 量 分 别 是4.0、4.69、4.69、9.38、18.75 和6.0 pg/ml。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0 软件分析，计量资料以x±s 表示， 两组间比较应用t 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RA 患者临床和实验室数据 20 例RA 患者均符合2010 年美国风湿病学会RA 的分类标准，根据DAS28 对患者疾病活动进行定量, 收集临床和实验室数据，见表1。

表1 RA 患者临床和实验室数据

2.2 抗高血压药物对RA 患者PBMCs 的影响 与刺激组相比，氯沙坦显著降低RA 患者外周血单个核细胞培养上清中的IFN-γ、IL-6、IL-17 和IL-22的浓度(P=0.005;0.000;0.000;0.000)，依那普利显著降低IFN-γ、IL-22 的浓度(P=0.009;0.002)，缬沙坦没有降低相关细胞因子的浓度。

2.3 抗高血压药物对RA 患者细胞因子及疾病活动度的影响 对于DAS28＜3.2 的RA 患者，氯沙坦能使IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17 和IL-22 显著下降(P=0.025; 0.005; 0.0046; 0.004; 0.035)， 而 对 于DAS28＞3.2 的RA 患者，氯沙坦能使IL-22 显著下降（P＝0.002），差异有统计学意义，依那普利和缬沙坦治疗后细胞因子的变化和DAS28 无相关性。

3 讨论

类风湿关节炎的发生和发展与免疫细胞功能的失衡有关，包括B 淋巴细胞、CD4+T 细胞及其亚群，在RA 发病机制中最主要的细胞因子包括Th1和Th17 细胞产生的炎性细胞因子。 RA 患者普遍患有心血管疾病, 超过70%的RA 合并CVC 的患者高表达炎性免疫学标志物, 包括C 反应蛋白等[10]。体内和体外实验已经有力证明某些抗高血压药物具有抗炎和免疫调节功能,然而这些药物在类风湿关节炎疾病中的潜力尚未证实,我们根据国际标准，探讨抗高血压药物对RA 患者外周血单个核细胞与疾病活性相应的变化中的作用。

图1 ELISA 检测几种降压药对RA 患者外周血单个核细胞分泌IL-2、IL-6、IL-17、IL-22 及IFN-γ 的影响

图2 100μm 依那普利、氯沙坦和缬沙坦对不同DAS28 评分患者外周血单个核细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22 的影响

RA 中的系统性高血压患者，治疗时优选血管紧张素转换酶抑制剂和/或血管紧张素II 受体阻断剂，这些药物用于治疗心血管疾病效果良好[11]。 心血管危险因素和全身炎症与RA 患者颈动脉内膜-中膜厚度的快速进展有关,因此有必要检测抗高血压药物是否参与免疫调节作用，这有利于为RA 患者选取更合适的治疗方案。本结果表明，在CD3 和CD28 抗体刺激RA 患者外周血单个核细胞（PBMC）时,氯沙坦能够显著降低PBMC 分泌的IF N-γ、IL-6、IL-17 和IL-22 的浓度, 依那普利和对PBMC 中促炎因子的产生几乎没有调节作用。

促炎性细胞因子参与RA 的发病，IL-17 是其中之一，它存在于滑膜中，能够加重RA 患者的病情，而且人们发现，IL-17 在动脉高压的发病中，对诱导血管生成因子的产生和促进内皮细胞的迁移起着关键的作用[12,13],IL-17 还激活血清和糖皮质激素调节激酶Ⅰ依赖途径, 引起水和钠的代谢不平衡，从而升高血压[14]。 因此，降低循环水平的IL-17不仅可以改善RA 的症状,也有利于高血压患者血压的控制。 氯沙坦在100μm 浓度下能够降低IL-17 的水平, 此外通过DAS28 对RA 患者病情进行评估, 氯沙坦能够降低轻中度患者细胞因子的水平,但是对重度评分的患者无影响,而依那普利和缬沙坦对细胞表达因子的没有影响。

IFN-γ 和IL-6 是两种具有多种功能的炎性细胞因子，如促进免疫细胞的增殖和参与免疫调节，IFN 家族与RA 的发病有关，IL-6 也是RA 治疗的靶点之一。

IL-6 与C-反应蛋白水平、关节肿胀程度、DAS 28、类风湿因子及抗瓜氨酸抗体相关。 IL-22 是一种多效细胞因子, 通过MAPK/NF-κB 和JAK-2/ST AT-3 信号通路的激活介导破骨细胞激活，破环关节软骨，IL-22 也可能会成为RA 治疗的靶点[15,16]。本实验发现氯沙坦显著降低RA 患者外周血单个核细胞中的IFN-γ、IL-6、IL-17 和IL-22 的浓度，依那普利显著降低IFN-γ、IL-22 的浓度， 缬沙坦没有降低相关细胞因子的浓度。 对DAS28＜3.2 的病人,氯沙坦能使IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17 和IL-22 显著下降， 而对于DAS28＞3.2 的病人,氯沙坦能使IL-22 显著下降。

对于评估的所有细胞因子,我们观察到疾病活动严重的患者（DAS28>3.2）氯沙坦仅能降低IL22的浓度,目前认为IL-22 是RA 发病过程中关键的细胞因子之一,IL22 的反应性和ESR、CRP、DAS28及骨损伤程度相关[17]，所以对于严重的RA 患者，氯沙坦也有一定的调节免疫反应的作用。 病情严重的患者可能因使用泼尼松等激素抗炎治疗而使免疫细胞对药物反应变得不敏感，但RA 是一种慢性和退行性疾病,很难在不进行抗炎的情况下招募患者，这使体外研究更加的困难。 本实验准备进一步选择RA 合并高血压，但未用抗高血压药物治疗的患者，观察这些患者在加服氯沙坦后，血清IL22等细胞因子浓度的变化及外周血单个核细胞内通路的改变来明确氯沙坦的作用机制。

综上所述，在依那普利、氯沙坦和缬沙坦这三种抗高血压药物中,氯沙坦对RA 患者的PBM C 有免疫调节作用，可以作为RA 合并高血压的选择药物。