小鼠过敏性哮喘模型肺组织中Th9 细胞相关因子的变化及意义

付宗强，牛小斌，张汇征，李永伟

（1.河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院检验科，河南 郑州450002；2.重庆市公共卫生医疗救治中心中心实验室，重庆 重庆400036）

过敏性哮喘是哮喘的主要类型,它以慢性气道炎症为特征，多种细胞及细胞因子参与，包括T 淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等，及这些细胞所分泌的细胞因子所形成的复杂的免疫调节网络[1,2]。目前研究认为Th2 细胞及其细胞因子谱可以调节过敏性气道炎症，导致气道的高反应性，Th1/Th2细胞失衡对于气道重构有促进作用[3]。 最近研究表明IL-9 在过敏性哮喘的进展过程中也起到重要的调节作用，IL-9 起初被认为是Th2 类细胞因子，它可以由IL-2、IL-4 和TGF-β 诱导产生，而被IFNγ 抑制[4]，但是研究发现IL-9 主要来自于一个新的细胞亚群，这个新的CD4+细胞亚群并不表达现有Th 细胞亚群的转录因子[5,6]，因此被称为Th9 细胞。本研究建立了小鼠哮喘模型, 检测小鼠肺组织中Th9 细胞相关因子的变化，进一步探讨Th9 细胞及其细胞因子在过敏性哮喘中的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 小鼠过敏性哮喘模型的建立 SPF 级雌性BALB/c 小鼠24 只（购自河南省实验动物中心），6~8w 龄，体重18~22g，用随机数字表将其分为对照组和哮喘模型组， 每组12 只。 模型组小鼠在第1天和第14 天腹腔注射0.2ml 卵白蛋白溶液（OVA，Grade Ⅴ,Sigma A5503）进行致敏，在第28~30 天将小鼠置于自制的5L 容器中超声雾化吸入1%浓度的OVA 进行激发，每天激发一次，每次20min，对照组则用同等体积的生理盐水代替处理。0.2mlOVA 致敏液含20μg OVA 和0.1ml 液态铝佐剂（Imject Alum，Thermo Pierce）。

1.2 小鼠气道反应性检测 末次激发24h （第31天）后，应用全身体积描记仪无创肺功能检测系统（Whole-body Plethysmograph, WBP，Buxco 公司）检测小鼠气道增强的呼吸间歇 （enhanced pause,Penh）。 将两组小鼠分别用生理盐水和梯度浓度的乙酰甲胆碱（Mch，Sigma A2251）进行激发后，转入WBP 中记录Penh 值, 并计算Penh%值 （Penh%=Mch 激发后的Penh/生理盐水激发后的Penh×100%），来反映小鼠气道阻力的变化程度。 所用的Mch 梯 度 浓 度 依 次 为6.25mg/ml、12.50 mg/ml、25.00 mg/ml 和50.00mg/ml。

1.3 小鼠标本的获取及处理 第32 天。

1.3.1 肺组织 摘取小鼠肺脏， 左侧肺叶用福尔马林固定，行HE 染色（n=6）；右侧肺叶放入液氮中，提取RNA， 逆转录，SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测IL-9、IL-9R 和转录因子PU.1 mRNA 表达水平（RNA 提取、逆转录及荧光定量PCR 试剂盒均购自TaKaRa 公司）。 每个标本设3 个副孔，各引物来自Primer Bank，引物序列见表1，由上海生工生物有限公司合成。 各步操作严格按照试剂说明书进行。

表1 各指标引物序列及扩增片段长度

1.3.2 支气管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid, BALF） 对小鼠进行气管插管, 用冷PBS（4℃）进行支气管肺泡灌洗3 次，0.8ml/次，收集灌洗液，回收率≥80%，3000r/min 离心5min， ELISA 法检测上清中各细胞因子(IL-4、INF-γ、IL-9 和OVA特异IgE，R&D 公司)的含量。各步操作严格按照试剂说明书进行。

1.4 统计分析 应用spss18.0 及GraphPad 7.0 进行数据分析和生成图表;所得数据以x±s 表示,数据正态分布和方差齐的, 两组间比较采用独立样本t检验，否则进行秩和检验；各因子间的相关系采用Pearson 线性相关分析；显著性检验水准为P＜0.05。SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 数据用2-ΔΔCt法计算mRNA 的相对表达量,相对表达量升高2 倍或降低0.5 倍，认为有意义。

2 结果

2.1 小鼠激发时的表现 哮喘模型组小鼠受OVA或Mch 激发时，起初表现为躁动不安，前爪搔鼻、呼吸急促，腹式呼吸、弓背呼吸，随后站立不动出现喘息症状；对照组小鼠受则没有这些表现，只是受到惊扰后的活动增加，偶有搔鼻，打喷嚏。

2.2 肺组织HE 染色 模型组小鼠支气管壁和肺泡壁明显增生，形态发生变化，更为狭窄不规则，并有大量炎症细胞浸润、充血水肿表现；而对照组小鼠的支气管和肺泡形态较规则， 无明显增生和细胞浸润表现。 见图1。

图1 小鼠肺组织HE 染色图片（×200）

2.3 Mch 激发后小鼠Penh 检测 对照组n=12，模型组n=12。 两组小鼠的Penh%随Mch 剂量的增加都有升高的趋势, 但是模型组小鼠上升的更快，特别是在受到25.00mg/ml 和50.00mg/ml Mch 激发后，两组的Penh%具有显著性差异。 见图2。

图2 两组小鼠受梯度剂量Mch 激发后Penh%的变化

2.4 BALF 上清中各细胞因子及OVA 特异IgE 含量 与对照组相比，过敏性哮喘小鼠BALF 上清液中Th2 类细胞因子IL-4、IL-9 水平显著升高，而Th1 类细胞因子INF-γ 则显著下降；另外对于OVA 特异的抗体IgE 的含量也是显著升高的。 对照组n=6，模型组n=6。

图3 小鼠BALF 中各细胞因子及OVA 特异IgE 的水平

2.5 模型组小鼠肺组织中Th9 相关分子mRNA 的相对表达量 采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 检测了两组小鼠肺组织中Th9 相关分子mRNA 的相对表达水平,结果显示，在模型组小鼠肺组织中IL-9、IL-9R 及Th9 细胞的关键性转录因子PU.1 mRNA 表达水平与对照组相比均显著增高，增高的倍数分别为2.64~4.42 倍、5.32~9.36 倍、4.89~8.67倍。 对照组n=6，模型组n=6。

图4 模型组小鼠肺组织中IL-9、IL-9R 及PU.1 mRNA 相对表达水平

2.6 小鼠肺组织中各个因子间的相关性分析 小鼠肺组织中PU.1 mRNA 的相对表达量与IL-9 mRNA、IL-9R mRNA 的相对表达量呈显著的正相关系（r=0.759，P=0.004；r=0.856，P=0.000），并且与小鼠BALF 上清液中的IL-9 及OVA 特异IgE 含量也有明显的正相关系（r=0.882，P=0.000；r=0.848,P=0.000）,见图5a、b、c、d；小鼠BALF 中OVA 特异IgE 的含量与IL-9 mRNA、IL-9R mRNA 相对表达量及BALF 中的IL-9 含量呈显著的正相关系 （r=0.807,P=0.002；r=0.851,P=0.000；r=0.918,P=0.000）,见 图5e、f、g； 小 鼠BALF 中IL-9 含 量 与 传 统 的Th2 类细胞因子IL-4 的含量呈正相关关系 （r=0.912，P=0.000）,而与传统的Th1 类细胞因子INFγ 有明显的负相关系（r=-0.799，P=0.002）,见图5h、i。

3 讨论

过敏性支气管哮喘是一种常见的慢性炎症性疾病，儿童的发病率高于成人，并具有遗传倾向，过敏性哮喘患者及其家人往往也患有其他过敏性疾病，如湿疹、过敏性鼻炎等[2,7]，患者体内IgE 水平升高,肺部有嗜酸性粒细胞、肥大细胞等浸润，并有Th 细胞亚群及其细胞因子谱的紊乱[8,9]。 大量的研究表明，过敏性哮喘患者体内存在Th1 细胞与Th2细胞的比例失衡，Th2 细胞过度分化及其相关的Th2 类细胞因子参与了哮喘的发生、发展，研究发现患者肺部高浓度的IL-4 可以诱导机体发生免疫球蛋白的类别转换（产生大量的IgE）[7]，另一种Th2类细胞因子IL-5 可以诱导和募集嗜酸性粒细胞在肺部聚集，Th2 细胞及细胞因子也参与了肺部组织细胞的重构[2,10]，然而传统的Th1/Th2 比例失衡理论并不能完全解释过敏性哮喘的发病机制。

图5 小鼠肺组织中Th9 相关因子与其他分子间的相关性分析

近年来的研究发现，IL-9 可能在过敏性哮喘的发生、发展中起到重要的作用，IL-9 常常与Th2类细胞因子相伴升高,人们往往将其归为Th2 类细胞因子[11]。然而Veldhoen[6]等人研究发现TGF-β 可以使IL-4、IL-5、IL-13 和转录因子GATA-3 表达缺失，转而产生大量的IL-9，将其归为Th2 类细胞因子并不妥当。与此同时，Dardalhon[5,12]的研究团队发现IL-4 与TGF-β 共存时可诱导IL-9+IL-10+Foxp3-的T 细胞产生,这一细胞亚群不同于传统的Th 细胞亚群，它以分泌IL-9 为主要特点，并不表达传统Th 细胞亚群的转录因子，因此将其定义为Th9 细胞。 与TH9 细胞相关的因子众多，主要包括转录因子PU.1、IRF1、IRF4 等，TH9 细胞分泌的细胞因子IL-9、IL-10,与其分化密切相关的细胞因子TGF-β、IL-4，IL-6、IL-21、IFN-γ 等, 以及TH9 细胞发挥免疫调节作用的相关受体, 目前研究表明TH9 的细胞表型与PU.1 的关系密切，它为TH9 特异的转录因子, 另外与小鼠TH9 细胞不同的是人类的TH9 细胞分泌IL-9 并不分泌IL-10[1,16,18]。 本研究复制了小鼠哮喘模型，并通过WBP 系统验证了哮喘模型小鼠气道的高反应性,以及哮喘患者呼气时相延长的特征,并对小鼠的肺组织进行了病理染色,结果显示模型组小鼠肺组织中有充血水肿表现，并有大量炎症细胞浸润，这与哮喘患者的肺组织病理表现一致。 本文以此为基础来探讨小鼠肺组织中Th9 细胞相关分子间相互关系。

有研究发现在过敏性哮喘患者肺组织中Th9数量与气道反应性呈正相关，IL-9 水平升高[13]； 有关动物实验显示，应用抗体中和IL-9 后，小鼠气道高反应性得到下降，肺组织中细胞浸润减少，气道炎症状态得到改善[14],IL-9 可以促进由Th2 类细胞因子IL-4 诱导的免疫球蛋白的类别转换,然而IL-9 对抗体的单独作用并不清楚[15]。PU.1 是转录因子ETS（E26 transformation specific or E-twenty-six）家族成员，它可以和Th9 细胞的IL-9 基因启动子直接结合，促进分泌IL-9，并在Th9 细胞的分化和功能的维持方面起到重要的作用, 因此PU.1 被认为是Th9 细胞关键性的必需的转录因子[16,17]。 但PU.1作为转录因子，已经确认110 多个直接的靶基因，这其中不仅包括细胞因子、细胞增殖分化基因，还包括受体、抗体以及补体基因，PU.1 与Th1 类、Th2类细胞因子及IgE 的关系并不十分清楚[18-20]。

本研究发现哮喘小鼠肺组织PU.1 mRNA 的相对表达量明显高于对照组,并与IL-9 mRNA、IL-9R mRNA 呈显著的正相关关系, 同时与其呈明显正相关的还有小鼠肺组织中的OVA 特异性IgE 抗体。 这些结果提示PU.1 可能在这些分子的表达过程中起到重要的作用。 本研究还检测了小鼠BALF上清中IL-4、IL-9、INF-γ 及OVA 特异的抗体IgE的含量， 以及小鼠肺组织中IL-9 mRNA、IL-9R mRNA 的相对表达水平,研究发现与对照组相比在小鼠哮喘模型肺组织中除INF-γ 水平显著下降外,其他分子均明显上升,小鼠哮喘模型肺组织中存在着IL-4/INF -γ 失衡,这与以往的研究结果一致。进一步的因子相关性分析发现IL-9 含量及其mRNA相对表达量与IL-4 及OVA 特异IgE 含量呈显著的正相关关系，但与INF-γ 具有明显的负相关系，这提示在小鼠哮喘模型肺组织中也存在着IL-9/INF-γ 紊乱,这些分子的改变可进一步通过受体作用于细胞，可能在哮喘的发病、发展中起到重要的调节作用。

Th9 细胞亚群的发现，及其相应的细胞因子谱的研究，使我们对许多疾病有了新的认识，它为Th细胞亚群的研究注入了新的活力,对于过敏性支气管哮喘来说,本研究及以往的结果提示Th9 及其相关的因子在哮喘的发生、发展中可能起到重要的调节作用,Th9 及相关分子也为过敏性哮喘的诊断和治疗提供了潜在靶点。