Wnt/β-catenin 通路及uPA 在子宫内膜癌中的作用机制研究

张玉洲，孙少霖，杨璇

（1.开封市妇产医院妇科，河南 开封475000；2 开封市妇产医院病理科，河南 开封475000）

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是一种子宫内膜上皮细胞恶性病变，EC 好发于围绝经期和绝经后的女性,其发病率在女性生殖系统疾病中排名第三[1]。 Wingless/β-连环蛋白（Wnt/β-cate nin）通路参与调节细胞增殖、细胞存活、细胞迁移和侵袭等细胞行为,已经有研究证实在EC 中Wnt/β-catenin 通路被过度激活可以促进肿瘤的增殖和转移[2]。 尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type plasminogen activator，uPA)是一种丝氨酸蛋白酶,参与细胞外基质纤维蛋白的溶解, 与肿瘤细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT） 以及肿瘤的转移密切相关[3,4]。 有研究发现Wnt/β-catenin 和uPA 的表达与EC 的病理学特征和预后有关， 但是关于Wnt/β-catenin 通路及uPA在EC 中的作用机制尚不明确[5]。 本文主要分析Wnt/β-catenin、uPA 在调节EC 细胞迁移和侵袭中的机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和材料 人EC 细胞株KLE 购自北纳生物（中国）。 DMEM 培养基以及胎牛血清购自Gibco（美国）。 KLE 细胞株来自一位68 岁的女性，是未分化的、II 型的子宫内膜腺癌细胞株。 Wnt-1过表达和uPA 沉默质粒由上海Genepharma 公司建造（中国）。 LipofectamineTM 2000（Invitrogen，美国）。CCK-8 试剂盒购自Dojindo（日本）。酶标仪型号ELX 800,公司为Bio-Teck（美国）。Trans-well 小室（Millipore,美国）。 Anti-Wnt-1（ab15251,41 kD）、anti-β-catenin （ab16051，94 kD）、anti-uPA（ab169 754，48 kD）、anti-β-actin （ab8226，42kD） 均来自Abcam 公司（美国）。Trizol（Invitrogen，美国）。Wnt-1、β-catenin、uPA、MMP-9、MMP2、N-cadherin 的定量PCR（quantitative PCR，qPCR）引物由北京三博远志生物技术有限责任公司（中国）设计和合成。逆转录试剂盒TaKaRa 和SYBR Prellix Ex TaqTM qPCR 试剂盒购自TaKaRa （日本）。 倒置显微镜（Olympus IX71，日本）

1.2 细胞分组和干预方法 将人EC 细胞KLE 在含有10%的胎牛血清的MEM 培养基中培养，培养条件为37℃，5%的CO2。 将细胞分为5 组，即对照组、阴性对照组、Wnt-1 组、si-uPA 组和Wnt-1+siuPA 组,其中Wnt-1 组通过转染Wnt-1 pcDNA 3.1质粒上调Wnt-1 的水平；si-uPA 组通过转染siuPA 质粒敲低uPA 的水平。 Wnt-1+si-uPA 组共同转染Wnt-1 pcDNA 3.1 以及si-uPA; 空质粒被用于阴性对照组。 每组细胞在转染48 h 后统一收集用于后续实验。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 qPCR 检测mRNA 使用qPCR 检测各组细胞转染后Wnt-1、uPA mRNA 的表达水平评估转染效率。 并分析迁移、侵袭相关基因的表达水平。 细胞裂解后使用Trizol 收集总RNA,通过在95℃下激活DNA 聚合酶5 min 进行PCR，然后进行40 个循环的两步PCR（95℃下10s 和60℃下30s），之后在75℃下延伸10min, 最后保持在4°C,β-actin 作为mRNA 的内参基因，使用2-ΔΔCT 法分析RNA 水平。

1.3.2 Western blot 检测蛋白表达水平 通过Western blot 检测各组细胞Wnt-1、β-catenin、uPA 蛋白的表达水平。 在液氮的保护下裂解细胞，12 000 rpm 离心15min 后收集上清液, 使用10%的SDSPAGE 凝胶用于电泳，电泳后使用PVDF 膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。 加入一抗室温震荡2 h，后在4℃孵育过夜，加入二抗。 使用βactin 作为内参。

1.3.3 CCK-8 检测细胞活力 CCK-8 法用于测定转染后细胞活力。 将细胞接种于96 孔板，加入10 μl CCK-8 试剂并在37℃，5%的CO2中培养4 h。使用酶标仪测量每个孔在450nm 处的吸光度（OD）。

1.3.4 细胞划痕实验检测细胞迁移 使用细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力。 细胞消化后收集，以每孔1:106的比例接种在6 孔板中，并用培养基在每个孔中培养至90%汇合。 通过200μl 移液管的尖端从上到下刮擦单层细胞。 然后用PBS 洗涤刮去的细胞。 之后并进一步培养24h。 在倒置显微镜捕获单层图像。 使用Image J 软件评估两侧前缘之间的间隙。

1.3.5 Transwell 实验检测细胞侵袭 收集3×104个细胞并转移到Transwell 小室的上室， 底室填充有10%FBS 的完全培养基。 孵育48h 后，用棉签轻轻扫除未侵入膜的细胞。 然后用20%甲醇固定细胞并用0.2%结晶紫染色。 在倒置显微镜下计数每场侵入底室的细胞。

1.4 统计学处理 所有实验数据均以平均值±标准偏差(SD)表示。统计分析软件为SPSS 19(SPSS，Inc.,Chicago,IL,USA)。 进行单因素方差分析（ANOVA）以评估实验组之间的差异。Speaman 被应用于检测相关性分析。 P<0.05 为比较差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞Wnt-1、β-catenin、uPA mRNA 和蛋白水平比较 在转染48 h 后, 分别使用qPCR 和Western blot 检测Wnt-1、β-catenin、uPA mRNA 和蛋白水平,结果显示Wnt-1 组的Wnt-1、β-catenin、uPA 水平均显著高于对照组和阴性对照组，说明转染实验成功，并且Wnt-1 的水平会影响uPA mRNA 和蛋白的表达。 si-uPA 组的Wnt-1、β-catenin表达水平变化不显著, 而uPA mRNA 和蛋白的水平显著降低，说明si-uPA 转染成功，并且si-uPA对Wnt-1、β-catenin 水平无显著影响。 此外，Wnt-1+si-uPA 组的Wnt-1 和β-catenin 也无显著变化且uPA mRNA 和蛋白水平显著低于Wnt-1 组，说明si-uPA 可以逆转Wnt-1 促进uPA 表达的作用，进一步说明uPA 的表达水平被Wnt-1 和βcatenin 调控，见表1、表2 和图1。

表1 转染后各组细胞Wnt-1、β-catenin、uPA mRNA 水平比较

表2 转染后各组细胞Wnt-1、β-catenin、uPA 蛋白水平比较

2.2 各组细胞活力比较 转染后使用CCK-8 法检测细胞活力，结果显示在培养48 h 后，Wnt-1 组细胞活力升高而si-uPA 组细胞活力降低，并且Wnt-1+si-uPA 组细胞活力显著低于Wnt-1 组，说明siuPA 可部分逆转Wnt-1 过表达促进细胞活力的作用，见表3。

2.3 各组细胞迁移和侵袭能力比较 分别使用细胞划痕实验和Transwell 实验分析各组细胞转染后的迁移和侵袭能力,结果显示在培养48 h 后，Wnt-1 组细胞迁移和侵袭率升高而si-uPA 组降低，并且Wnt-1+si-uPA 组细胞迁移和侵袭率显著低于Wnt-1 组，说明si-uPA 可部分逆转Wnt-1 过表达促进细胞迁移和侵袭的作用，见表4。

图1 Western blot 检测各组细胞中Wnt-1、β-catenin、uPA 蛋白水平

表3 各组细胞活力比较

表4 各组细胞迁移和侵袭能力比较

2.4 各组迁移侵袭相关基因表达水平比较 通过检测各组迁移、侵袭相关基因的表达水平发现,Wnt-1 组MMP2、MMP9、N-cadherin mRNA 水 平 升 高而si-uPA 组降低,并且Wnt-1+si-uPA 组MMP2、M MP9、N-cadherin mRNA 水平显著低于Wnt-1 组，说明si-uPA 可部分逆转Wnt-1 过表达促进细胞MMP2、MMP9、N-cadherin mRNA 表 达 水 平 的 作用，见表5。

表5 各组迁移侵袭相关基因表达水平比较

3 讨论

调查显示EC 的发病率在全世界范围内均呈现上升趋势, 中国女性子宫内膜癌病例在过去10年中有所增加。 根据临床特征和发病机制，子宫内膜癌可分为两类，I 型子宫内膜癌通常发生在围绝经期妇女中, 与肥胖和雌激素暴露有关；II 型子宫内膜癌在老年女性中更常见，预后比I 型更差[6]。手术切除和放疗是治疗EC 的最常用、有效的手段,然而仍有患者存在复发及转移影响预后, 研究认为EC 的远端转移以及淋巴转移是影响患者预后的主要因素, 因此探究EC 的发病机制可为治疗EC提供新思路[7]。

EMT 是指上皮细胞获得间充质细胞的运动和侵袭特征,是肿瘤侵袭-转移级联中的重要过程，其中上皮细胞层失去极性以及细胞-细胞粘附，是影响肿瘤预后的危险因素之一[8]。 uPA 可将纤溶酶原水解转化为活性形式,从而参与基底膜和细胞外基质的降解，并且uPA 对基本细胞过程有影响，包括趋化性，迁移，侵袭，粘附，增殖和血管生成[9]。 此外，EMT 涉及多种信号通路，包括核因子-κB 相关通路、Notch 通路、Ras 以及Wnt/β-catenin 等，在Wnt/β-catenin 通路中，Wnt 会避免β-catenin 被降解并促进β-catenin 在细胞质中积累，β-catenin 被激活后进入细胞核调节基因的表达[10，11]。 本次研究使用人EC 细胞作为研究对象，通过质粒转染技术过表达Wnt-1 或敲低uPA，通过qPCR 以及Western blot 方法检测Wnt-1、β-catenin 通路以及uPA mRNA 和蛋白的表达水平。结果显示过表达Wnt-1可以促进β-catenin 和uPA 的表达水平，而si-uPA不会影响Wnt-1、β-catenin 表达, 但si-uPA 会逆转Wnt-1 促进uPA 表达的总用, 这不但说明了转染实验成功,也提示在EC 中,uPA 对Wnt/β-catenin通路影响不显著，而Wnt/β-catenin 通路可调节u-PA 的表达从而调节EC 细胞的生物学行为。 过往也有研究显示在眼角膜上皮细胞中,Wnt/β-catenin通路会促进uPA 的水平[12]。 Asuthkar 等[13]的研究也发现Wnt/β-catenin 通路具有调节uPA 水平的特点。 这说明在EC 中，Wnt/β-catenin 通路可以调节uPA 水平。

为进一步分析Wnt/β-catenin 通过uPA 对EC细胞行为的影响,我们分别用细胞划痕实验和Transwell 实验检测Wnt/β-catenin 和uPA 对迁移和侵袭的影响,结果显示Wnt-1 组细胞活力、细胞迁移和侵袭能力升高而si-uPA 组降低,并且Wnt-1+siuPA 组细胞活力、 细胞迁移和侵袭能力显著低于Wnt-1 组，这说明si-uPA 可部分逆转Wnt-1 过表达促进细胞活力、细胞迁移和侵袭能力的作用。 此外, 进一步的研究发现si-uPA 可部分逆转Wnt-1过表达促进细胞MMP2、MMP9、N-cadherin mRNA表达水平。MMP2、MMP9 的过表达可以促进细胞外基质的讲解提高细胞迁移能力,而N-cadherin 的升高会促进细胞的迁移和侵袭能力,与EC 的预后有关[14，15]。 Liu 等[16]研究显示在缺氧情况下,胃癌细胞中的Wnt/β-catenin 通路被激活，并可能通过促进uPA 和基质金属蛋白酶的表达促进胃癌细胞的迁移和侵袭。Tao 等[17]的研究显示Wnt/β-catenin 通路的上调会促进MMP2、MMP9 以及N-cadherin 的表达促进细胞的迁移和侵袭。 已经有临床研究显示高水平的uPA 预示着更差的EC 分期和更高风险的转移[18]。 Ghasemi 等[19]的研究显示uPA 的过表达会促进细胞的迁移和侵袭。

综上所述,在EC 细胞中,Wnt/β-catenin 的过表达会通过促进uPA 的表达促进EC 的迁移和侵袭，这可能成为治疗EC 的新思路。 但是关于Wnt/βcatenin 通过调节uPA 并参与EMT 的机制还需要进一步研究。