基于αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信号通路研究调心方对APP／PS1 双转基因AD 小鼠学习记忆和突触可塑性的影响

王晓雯 ，钱 红 ，沈春娟 ，李燕军 ，袁海新 *，王 健

1 上海市第五康复医院，上海 201699；2 上海中医药大学康复医学院，上海201203

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种不可逆转的中枢神经系统退行性疾病。 目前，全世界范围内有超过5 000 万AD 患者，到2050 年，预计将有 15 000 万 AD 患者［1］。 AD 的主要发病人群为60 岁以上的老年人，其患病率随人口老龄化日益增加。在我国60 岁以上人群的患病率为0.53%～5.67%，85 岁以上为 20%～50%［2］。 AD 的临床特征是隐匿起病，早期主要出现近期记忆力减退，随着病情的发展，视空间、计算力、语言、运动神经系统功能均可出现障碍，在后期甚至出现妄想、错觉、焦虑、抑郁等精神症状，不仅对老年人的日常生活能力造成了严重的影响，也给照料者和社会带来了沉重的负担［3］。 目前有许多研究进行 AD 治疗药物研发，据不完全统计正在研发／已研发的药物有200 多种，但其中99%药物因中期结果无效或副作用不能耐受等原因导致失败［4］，仅有极少数药物被批准用于治疗AD，而这些药物只能控制症状，并无法改变疾病的进程。 如多奈哌齐就是临床上治疗轻中度AD 的常用药物［5］，它是一种可逆性的乙酰胆碱酶抑制剂，能有效改善认知功能。

近年来，随着中医学对AD 防治的深入研究，发现中医药在AD 的防治方面有着明显的优势。 林水淼教授［6］结合多年临床经验提出轻中度AD 患者以心气虚证为主，治疗宜从心入手，研究发现调心方能有效改善氧化损伤型类AD 大鼠空间记忆能力和神经元钙稳态［7］。本课题组前期研究发现，经过调心方治疗后，APP／PS1 双转基因小鼠的学习获取能力和空间记忆保持能力均明显提高［8］。 但有关于其具体的作用机制还未明确。 APP／PS1 双转基因小鼠能够模仿AD 的病理变化，常被用于AD 和神经退行性病变的神经生物学研究［9］。 αCaMKⅡ-CREBBDNF 信号通路是形成及维持空间学习记忆能力和长时程增强（long-term potentiation，LTP）的重要信号通路之一［10］。 本研究基于 αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信号通路探讨调心方改善AD 学习记忆和突触可塑性的具体作用机制，选择采用3 月龄APP／PS1双转基因小鼠为AD 病理模型，通过电生理技术诱导小鼠海马CA1 区LTP，实时荧光定量聚合酶链反应 （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法检测小鼠海马区α 钙／钙调素依赖激Ⅱ（alpha calcium ／calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，αCaMKⅡ）、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclic AMP response element binding protein，CREB）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、突触后致密物 95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）mRNA 表达；采用 Western blot 法检测 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF、PSD-95 蛋白表达。

1 实验材料

1.1 实验动物

选取 SPF 级 3 月龄 APP／PS1 双转基因雄性小鼠 54 只，体质量（25.22±1.71）g，按照随机数字表法将APP／PS1 雄性小鼠分为模型组、多奈哌齐组、调心方组。另设同月龄同品系同月龄C57／BL6 雄性野生型小鼠 18 只为正常组，体质量（30.49±1.59）g。以上实验动物均由南京大学模式动物研究所提供，品系编号为 D00268，许可证号：SCXK（苏）2015-0001。 动物实验在上海中医药大学动物实验中心进行，实验过程中动物饲养和操作严格遵循实验动物伦理学准则。

1.2 主要仪器与试剂

超薄切片机（德国Leica 公司）；全波长酶标仪、梯度PCR 仪（美国Thermo 公司）；伯乐电泳仪、伯乐宽式水平电泳槽、转印电泳槽（美国BIO RAD 公司）；水浴锅、隔水式恒温培养箱（上海精密实验设备公司）；化学发光成像仪（上海天能公司）。 Trizol、随机引物（美国 Invitrogen 公司）；RIPA、PMSF、BCA试剂盒、PBS、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、5Xloadingbuffer、SDS-PAGE 电泳液、Western 转膜液（上海碧云天生物技术公司）；BDNF 抗体、p-CREB（S133）抗体、p-αCaMKⅡ（T286）抗体、GAPDH 抗体、PSD95抗体（英国 Abcam 公司）；αCaMKⅡ-α、CREB、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H＋L）（美国CST 公司）。

1.3 主要药物

调心方颗粒（江苏江阴天江药业有限公司），其成分主要包括党参、石菖蒲、桂枝、甘草、白芍、龙骨、远志等；盐酸多奈哌齐（江苏豪森药业股份有限公司，生产批号：H20030472）。

2 实验方法

2.1 干预方法

参照药理试验中动物与人体间的等效剂量换算标准进行折算，多奈哌齐组和调心方组均按照人的等效剂量（体质量：60 kg）折算出药物剂量。 正常组和模型组给予等量生理盐水 10 mL／（kg·d）；多奈哌齐组给予盐酸多奈哌齐灌胃，剂量为 0.05 mg／（kg·d）；调心方组给予调心方颗粒灌胃，剂量为0.057 g／（kg·d）［11］；4 组小鼠于 3 月龄时进行灌胃给药处理，1 次 ／d，连续灌胃 3 个月。

2.2 取材

2.2.1 脑片制备 4 组各随机选取5 只小鼠，于小鼠腹腔注射20%的水合氯醛，待小鼠麻醉后，快速断头，取出脑组织移至95%O2＋5%CO2混合气饱和的人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中，ACSF 溶液温度为 0 ℃，放置 1 min。 去除前脑和小脑，用胶水将剩余脑组织块粘在切片台上。 用振动切片机冠状切取海马脑片，海马脑片大小为400 μm，放入34 ℃的孵育槽中孵育0.5 h，然后放在（25±1） ℃持续通入 95%O2＋5%CO2混合气饱和的 ACSF溶液中2～8 h。

2.2.2 脑组织样本制备 4 组各随机选取7 只小鼠，将小鼠腹腔注射20%的水合氯醛，待小鼠麻醉后，快速断头，取出脑组织移置-20 ℃的冰盒上，迅速剥离左右两侧海马置于EP 管中，储存于-80 ℃冰箱内，以待RT-qPCR 和Western blot 检测备用。

2.3 指标检测

2.3.1 离体海马CA1 区LTP 诱导 待脑片孵育结束后，在显微镜下将脑片移进记录槽中，使用32～34 ℃的 95%O2＋5%CO2混合气饱和的 ACSF 溶液持续灌流，速度为3 mL／min，在海马CA1 区记录兴奋性突触后电位。 具体步骤如下：①确定海马CA1区：显微镜下确定海马的CA1 区。②准备刺激电极、记录电极：选择1 个单级钨丝的微电极刺激作为刺激电极，尖端直径1～2 μm，尖端暴露长度为15～40 μm；记录电极为玻璃管记录电极，ACSF 溶液充满玻璃管，电阻1～5 MΩ，将其放在CA1 区的同一层。③ 刺激海马CA1 区：将刺激电极放在海马CA1区 stratum radium 层，刺激 Shaffer collateral 纤维，以0.033 Hz 频率，100 μs 波宽，每隔 30 s 给 1 个刺激，刺激强度为0.1～0.7 mA。 ④ 记录场兴奋性突触后电位：每给1 个刺激记录1 个场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP），以 30%fEPSP 最大刺激强度为基线，记录30 min；在前30 min 基础 fEPSP 曲线保持稳定后，LTP 应用100 Hz 高频刺激（high frequency stimulation，HFS）诱导1 s，LTP 诱发成功后持续记录 60 min，选择其中的第50～60 min 的fEPSP 平均斜率观察LTP 水平。LTP 是在强直剌激下诱发的突触传递功能长时间增强现象，反映了突触传递效能的持久变化［12］。⑤绘制刺激强度-反应曲线：以刺激强度为横坐标，fEPSP斜率为纵坐标，绘制刺激强度-反应曲线（input-output curve，I／O），I／O 曲线能够反映神经环路的基本突触传递特性。 ⑥观察短时程突触可塑性：在海马Schaffer 侧枝CA1 区的突触通路上，从20～250 ms 双脉冲刺激间隔的双脉冲易化（paired pulse facilitation，PPF）即短时程的突触可塑性。 在 30%fEPSP 最大刺激强度的刺激下，一般会产生前后2 个突触后兴奋电位，后1 个fEPSP 斜率／前1 个fEPSP斜率就是PPF 值。 它可通过观察突触后的反应来推测突触前神经递质的释放情况。 以上数据采用Clampfit 软件进行分析。

2.3.2 海马 CA1 区 αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95mRNA 含量检测 采用RT-qPCR 法检测海马αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95mRNA 的含量。4 组小鼠各随机选取4 个海马组织，采用Trizol 法提取总 RNA， 使用酶标仪检测总RNA 的浓度和纯度，光密度（optical density，OD）比值可以判断RNA纯度，OD260／OD280在 1.8～2.0 之间，表示 RNA 纯度较好。 RNA 纯度测定后，利用 cDNA 合成试剂盒将2 μg RNA 逆转录为 cDNA。PCR 扩增条件：95 ℃预变性 2 min，需执行 1 个循环。 先 95 ℃变性 5 s，后60 ℃退火10 s，需执行45 个循环。循环结束后缓慢升温，生成各基因的熔解曲线。 采用GAPDH 作为内参基因，利用荧光定量 PCR 仪对目的基因αCaMKⅡ、BDNF、CREB、PSD-95 进行定量检测。 使用 PCR系统软件，观察熔解和扩增曲线，记录各组目的基因的 Ct 值，相对定量采用 2-△△Ct法。 引物由 NCBI Primer-blast 设计，序列参照Gene Bank 数据库中的基因序列，由苏州金唯智公司合成。 序列为：①BDNF：上游 5’-GGTATCCAAAGGCCAACTGA-3’；下游 5’-CTTATGAATCGCCAGCCAAT-3’。 ② CREB：上游 5’-CAGACAACCAGCAGAGTGGA-3’，下游5’-GGGCTAATGTGGCAATCTGT-3’。 ③ GADPH：上游 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。 ④ PSD-95：上游 5’-CTATGAGACGGTGACGCAGA-3’，下游5’-CGGGAGGAGACAAAGTGGTA-3’。⑤αCaMKⅡ：上游 5’-CAGCCACTGTATCCAGCAGA-3’，下游5’-GAGGCCAGCAACAGATTCTC-3’。

2.3.3 海马 CA1 区 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF和PSD-95 蛋白含量检测 采用Western blot 法检测海马 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 的蛋白含量。 4 组随机选取3 个在-80 ℃冰箱中储存的海马组织，按蛋白提取试剂盒上操作要求提取蛋白，使用BCA 法测定各组蛋白浓度。 绘制标准曲线，计算出4 组样本的蛋白浓度，使用RIPA 裂解液将各组蛋白定容至等体积，浓度为1 μg／μL，在100 ℃水浴锅中煮沸10 min，置于-20 ℃冰箱中备用。 经过SDS-PAGE 凝胶配制、凝胶电泳、转膜、蛋白印迹后，进行图像分析。 所有条带均采用Al-Phaview SA 软件进行处理分析。

2.4 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析。 计量资料用（）表示，数据符合正态分布且方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验；方差不齐用Wilcoxon 秩和检验。 重复测量数据用重复测量方差分析。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 4 组小鼠海马 CA1 区 LTP 比较

见图1。

图 1 4 组海马 CA1 区 LTP 图Figure 1 LTP figure of hippocampal CA1 in four groups

3.2 4 组小鼠海马区 αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和PSD-95 mRNA 表达比较

见表 1、图 2。

表 1 4 组海马 αCaMKⅡ、CREB、BDNF、PSD-95 mRNA 表达比较（）Table 1 Comparison of αCaMKⅡ, CREB, BDNF, PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups （）

表 1 4 组海马 αCaMKⅡ、CREB、BDNF、PSD-95 mRNA 表达比较（）Table 1 Comparison of αCaMKⅡ, CREB, BDNF, PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups （）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。Note: Compared with the normal group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

PSD-95 1.00±0.34 0.62±0.051）1.00±0.072）0.94±0.112）组别正常组模型组多奈哌齐组调心方组n 4 4 4 4 αCaMKⅡ1.00±0.22 0.58±0.071）0.93±0.082）0.91±0.072）CREB 1.00±0.29 0.63±0.001）0.88±0.19 0.96±0.092）BDNF 1.00±0.20 0.51±0.111）0.91±0.272）0.94±0.032）

图 2 4 组小鼠海马区 αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95 mRNA 表达比较Figure 2 Comparison of αCaMKⅡ，CREB，BDNF and PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups

3.3 4 组小鼠 海马 区 p-αCaMK Ⅱ、p-CREB、BDNF和PSD-95 的蛋白表达比较

见表 2、图 3、图 4。

表 2 4 组海马区 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 蛋白表达比较（）Table 2 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression in the hippocampus in four groups （）

表 2 4 组海马区 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 蛋白表达比较（）Table 2 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression in the hippocampus in four groups （）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。Note: Compared with the normal group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

PSD-95 1.00±0.12 0.58±0.081）0.85±0.072）0.92±0.092）组别正常组模型组多奈哌齐组调心方组n 3 3 3 3 p-αCaMKII 1.00±0.20 0.47±0.061）0.46±0.06 0.86±0.142）p-CREB 1.00±0.10 0.66±0.081）0.90±0.032）0.95±0.112）BDNF 1.00±0.05 0.65±0.091）0.86±0.092）0.90±0.092）

4 讨 论

中医学将AD 归于“呆病”“郁证”“癫证”等范畴，对于AD 不同阶段的病机、治则、治法尚未达成共识。AD 主要临床表现为认知功能障碍，有研究发现AD 的基本病机为：心气虚衰，气不生神，为本虚；痰滞瘀阻，蒙蔽神窍为标实。 根据“缓则治其本”“治病必求于本”的原则，从“心”入手，调心气可以治疗AD。 调心方中党参功擅补心气，安神增智为君；桂枝温通血脉，振奋心阳为臣；石菖蒲安神益智，开窍为佐；远志通窍豁痰，增智为使。 诸药配伍具有益心气化痰开窍之功效［13］。 有临床研究显示，调心方能够改善轻、中、重度AD 患者的认知功能和日常生活能力，通过提高后扣带回与脑功能区的连接，从而达到改善脑功能的作用［14］。 有基础研究发现，调心方可以抑制神经细胞凋亡、乙酰胆碱的水解、胶质细胞激活、Tau 蛋白的过度磷酸化、Aβ 寡聚体的生成，减轻神经炎症反应、抗氧化应激等多个靶点和途径，从而达到改善AD 发生、发展的作用。 但有关于调心方是如何改善AD 患者学习记忆能力的具体作用机制还不够明确，因此本研究尝试基于αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信号通路探讨调心方对APP／PS1 双转基因AD 小鼠学习记忆和突触可塑性的影响，以期为探讨调心方改善AD 患者学习记忆能力的具体作用机制提供依据。

图 3 4 组海马区 p-αCaMKⅡ，p-CREB，BDNF 和PSD-95 的蛋白条带显影Figure 3 Protein band development on p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression of the hippocampus in four groups

4.1 调心方能够改善APP／PS1 双转基因AD 小鼠海马突触可塑性

LTP、PPF、I／O 是突触功能可塑性的 3 个重要电生理指标。本研究结果显示，4 组分组效应和刺激强度效应均无明显区别；分组和刺激时间因素无明显的交互作用；在0.1～0.7 mA 刺激强度下，4 组小鼠海马 I／O 曲线斜率无明显区别；在 50、100、200、250 ms的不同刺激间隔下，4 组PPF 易化无明显区别。 这说明APP／PS1 小鼠海马LTP 的损伤与基本突触传递和突触前神经递质释放无关，APP／PS1 双转基因小鼠的基本突触传递效能无发生障碍，这提示6 月龄的APP／PS1 小鼠海马LTP 的损伤与基本突触传递和突触前神经递质释放无关。 第50～60 min 的海马fEPSP 斜率组间比较结果显示，与正常组比较，模型组小鼠fEPSP 斜率明显降低，提示模型组小鼠海马LTP 受损。 与模型组比较，调心方组fEPSP 斜率均明显提高。这说明调心方可改善APP／PS1双转基因AD 小鼠LTP 的抑制，改善其突触传递效能，从而提高突触可塑性，改善学习记忆能力。 这与ROLLAND 等［15］发现突触可塑性与神经系统的发育、损伤、修复及学习记忆等密切相关的研究结果一致。

图 4 4 组海马区 p-αCaMKII，p-CREB，BDNF 和 PSD-95 的蛋白表达比较Figure 4 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression of the hippocampus in four groups

此外，本研究还发现，与正常组比较，6 月龄的APP／PS1 双转基因 AD 小鼠海马 PSD-95 蛋白和mRNA 表达明显降低；与模型组比较，调心方组小鼠海马区的PSD-95 mRNA 和蛋白表达明显提高。这说明APP／PS1 双转基因AD 小鼠脑内有突触可塑性受损的现象，LTP 受到抑制；经过调心方治疗后PSD-95 的蛋白活性和基因表达明显提高，LTP 抑制得到改善，突触可塑性提高，从而改善学习和记忆能力。 突触后致密物在突触可塑性中具有重要作用，PSD-95 蛋白通过与突触后致密区多种蛋白分子的相互作用，起到了调节突触可塑性的功能，它在LTP 的形成及维持过程、突触可塑性、学习记忆等方面具有关键性的作用［16］。APP ／PS1 双转基因 AD小鼠海马PSD-95 蛋白活性明显降低，PSD-95 异常表达会导致LTP 受到抑制，进而诱发突触可塑性发生改变，使AD 小鼠出现依赖海马的学习记忆功能的缺陷，这与魏鹏［17］的研究结果一致。

4.2 调心方能够调节APP／PS1 双转基因AD 小鼠海马αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信号通路水平

αCaMKⅡ通过Thr286 位点自身磷酸化成为活化状态，它的激活是其突触功能调节及学习记忆的结构基础［18］，是 LTP 形成的重要介质，对实现信息的储存具有重要作用。 Ca2+进入细胞内与CaM 结合形成Ca2+-CaM，能够活化CaMKI，磷酸化后的αCaMKⅡ可以直接活化 CREB［19］。 CREB 是 LTP 产生的重要调节因子，CREB 缺失会导致LTP 出现明显损伤［20］，它位于 133 位点的丝氨酸残基（Ser133）的磷酸化对多种与学习记忆相关的基因转录起着重要作用。BDNF 是CREB 的经典下游靶基因，其基因启动子区域含有CRE 序列，CREB 可与CRE 序列结合，引起 BDNF 的转录增加［21］，BDNF 是 LTP 和突触传递重要的调节器之一，在突触可塑性、长时记忆的形成等方面起到重要作用。

本研究结果显示，与正常组比较，模型组海马p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 蛋白水平和 αCaMKⅡ、CREB 和BDNF mRNA 明显降低，这与模型组PSD-95 表达、LTP 受到抑制的结果相互印证；与模型组比较，调心方组海马 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF蛋白水平和 αCaMKⅡ、CREB 和 BDNF mRNA 表达明显提高。 这提示，调心方组能有效改善APP／PS1双转基因AD 小鼠海马αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信号通路水平。 调心方可能通过激活αCaMKⅡ，上调了αCaMKⅡ的磷酸化蛋白水平及αCaMKⅡmRNA表达，进而激活其下游的CREB，使得CREB 磷酸化水平及CREB mRNA 表达增加，促进其下游BDNF的基因转录和蛋白合成，提高 BDNF mRNA 和BDNF 蛋白表达；BDNF 表达增加可在αCaMKⅡ的翻译过程中上调PSD-95 磷酸化水平，引起TrkB 对BDNF 的敏感性增加，从而激活 CREB-BDNF 信号通路，使突触可塑性发生改变，提高LTP，从而改善突触可塑性及学习记忆能力。 这与ESCOBAR 等［22-23］等研究结果一致。

5 小 结

调心方能够改善APP／PS1 双转基因AD 小鼠海马CA1 区 LTP、提高PSD-95 mRNA 和蛋白的表达，从而改善APP／PS1 双转基因AD 小鼠学习记忆功能和突触可塑性，其作用机制可能与其上调海马αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信号通路水平有关。