阳和汤对兔膝骨关节炎木瓜蛋白酶模型IL-1、TNF-α 的影响

洪振强，高弘建，何俊君，黄泽灵

福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种以关节疼痛、僵硬、功能受限甚至关节畸形、残废为主要表现的骨科常见病，目前中国已有超过 1 亿 OA 患者［1］。药物是治疗骨关节炎的主要手段之一，临床多采用非甾体抗炎药（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）等为主的西药进行治疗，虽可暂时缓解关节疼痛、改善功能，但无法修复受损的关节软骨、阻止OA 进一步发展，长期服用此类药物还会出现胃溃疡、胃出血、肝肾损害等不良反应。 中医药可以修复损伤的软骨组织和细胞，从而保护关节软骨，防治骨关节炎具有疗效可靠、价格低廉、不良反应少的特色与优势［2］。阳和汤源自清代王洪绪《外科证治全生集》，原为治疗外科阴疽证的经典方剂，现在广泛应用于内科杂症，特别是痹证，为攻补兼备、刚柔相济之治痹良方。 有研究表明，阳和汤治疗膝骨关节炎的临床疗效明显，可有效缓解膝关节疼痛，改善膝关节功能［3-6］。 但是，有关阳和汤防治骨关节炎具体作用机制的研究还较少，也不够深入，值得进一步探讨。 因此，本研究通过建立兔膝骨关节炎木瓜蛋白酶模型并予阳和汤灌胃，以探讨阳和汤防治骨关节炎的作用及其作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

选择健康新西兰兔32 只，4～6 月龄，体质量（2.25±0.25）kg，雌雄各半，由福建中医药大学实验动物中心代购并饲养［许可证号：SCXK（闽）2012-0001］。按照随机数字表法分为对照组、模型组、阳和汤组、筋骨痛消丸组，每组8 只。 动物处理参照中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，并经福建中医药大学动物伦理委员会审核批准。

1.2 主要仪器、药品及试剂

生物组织包埋机（湖北省宏业医用仪器有限公司，BM-Ⅶ）；石蜡切片机（美国 Thermo 公司，HM315）；低温高速离心机（美国BECKMAN 公司，64R）；酶联免疫检测仪（美国Biotek 公司，Elx808）；光学显微镜（日本 Olympus 公司，BX40）；酶标仪（美国 Biotek 公司，Elx808）。

阳和汤由福建中医药大学国医堂提供，采用清代王洪绪《外科证治全生集》原方（熟地黄30 g，鹿角胶 9 g，麻黄 2 g，白芥子 6 g，肉桂 3 g，姜炭 2 g，生甘草 3 g），煎煮后制成浓度 1 g／mL 的溶液，55 mL／剂；筋骨痛消丸（河南省洛正制药厂，生产批号：Z10970117），由丹参、桂枝、香附、地黄、白芍、牛膝、秦艽等药物组成，以蒸馏水配制成浓度1 g／mL的溶液，36 mL／盒；木瓜蛋白酶（美国 Sigma 公司，生产批号：107147）；兔白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）酶联免疫检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，生产批号：F20190）；兔肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，生产批号：F2041）；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，生产批号：WS20060401）；0.9%NaCl 注射液（北京天坛生物制品股份有限公司）；4%多聚甲醛、EDTA 脱钙液（上海国药集团）。

2 实验方法

2.1 动物模型制备

新西兰兔适应性饲养2 周后，除对照组外，其余各组膝关节腔注入木瓜蛋白酶造模。 选兔双膝为手术部位，耳缘静脉麻醉（戊巴比妥钠，30 mg／kg）后仰卧固定，常规备皮、消毒、铺巾。 轻度弯曲兔膝关节，从关节的正中间或者关节的两侧进针，手下出现落空感则表示针头进入了关节腔，随后可往关节腔内注入0.5 mL 1.6 %木瓜蛋白酶生理盐水溶液，每隔3 d 注射1 次，共注射3 次。每日定时分2 次于空旷场地驱赶，共强迫兔活动30 min，连续驱赶4 周。

2.2 干预方法

造模成功4 周后，参照“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”进行换算。 筋骨痛消丸具有活血行气、温阳通经、消肿止痛的作用，阳和汤与筋骨痛消丸均可有效缓解膝骨关节炎患者局部疼痛肿胀，疏利关节，临床效果显著。 因此本研究选择筋骨消痛丸作为阳性对照。 阳和汤组按 6 g／（kg·d）的量给予阳和汤灌胃，筋骨痛消丸组按 6 g／（kg·d）的量给予筋骨痛消丸灌胃，以上2 组均给药1 次／d，连续用药5 周。 对照组、模型组常规饲养，无其他特殊处理。 停药1 周后，经腹腔麻醉后取材，耳缘静脉空气栓塞处死全部动物。

2.3 取材

2.3.1 取材前准备 取材前12 h 动物禁食不禁水，麻醉后取材。

2.3.2 血清采集 采用腹主动脉采血法。 打开兔腹腔，分离腹主动脉，一次性采血针取血5 mL，待血液静置分层后，低温高速离心机（4 ℃，3 000 r／min）离心20 min，取血清，-80 ℃冰箱保存。

2.3.3 关节液采集 兔髌骨内缘行纵行切口，由皮肤向下逐层分离至关节囊，反复屈伸关节将关节液挤压至髌上囊内侧，轻轻划开关节囊，注入1.5 mL生理盐水反复抽吸后将关节液尽量抽出，低温高速离心机（4 ℃，15 000 r／min）离心 15 min，取上清液，－80 ℃冰箱保存。

2.3.4 软骨组织采集 切开兔膝关节囊，分离软组织后快速切取股骨内髁，粗修后于4%多聚甲醛中固定24 h，10% EDTA 脱钙完全后修切，常规石蜡包埋后切片。

2.4 指标及检测方法

2.4.1 软骨组织形态学观察 取上述的软骨组织石蜡切片，常规脱蜡后，分别进行苏木素-伊红染色：苏木素染液20 min，10%盐酸酒精分色3 s，自来水返蓝20 min，0.5%伊红染液5 s。 染色完成后均采用95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，光学树脂固封。 光镜下对组织结构进行观察及图像采集。

2.4.2 软骨损伤程度评价 采用 Mankin's 评分标准［7-8］评价软骨的损伤程度。 见表 1。

表1 Mankin's 评分标准Table 1 Mankin's score

2.4.3 血清及关节液中白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α 含量检测 运用酶联免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测血清及关节液中 IL-1、TNF-α 含量。 方法及步骤如下：按照ELISA 试剂盒的操作步骤依次操作，以酶标仪（波长450 nm）读取A 值，绘制标准曲线并计算各样品的 IL-1、TNF-α 浓度。

2.5 统计学方法

3 结 果

3.1 4 组实验情况

实验期间各给药组新西兰兔精神状态好，排便、体温和皮毛等未见异常，其体质量、进食量与对照组基本一致。 实验过程动物无死亡。

3.2 4 组软骨组织形态学比较

3.2.1 4 组软骨组织肉眼观察 ① 对照组：股骨内侧髁关节软骨色泽鲜红，表面光滑，无软骨破坏和骨赘形成。②模型组：股骨内侧髁软骨无光泽，局部凹凸不平，可见软骨缺损及骨赘形成。③阳和汤组：股骨内侧髁软骨表面欠光滑，可见轻微软骨缺损和骨赘形成，其程度明显较模型组轻。 ④筋骨痛消丸组：股骨内侧髁软骨表面欠光泽，缺损和骨赘较模型组轻。 见图1。

图1 肉眼观察关节软骨结构Figure 1 Observation of articular cartilage structure with naked eyes

3.2.2 4 组软骨组织光镜观察 ① 对照组：软骨表面光滑、完整，软骨组织的4 层结构（表浅层、移行层、辐射层、钙化层）分层清晰，软骨细胞成柱状排列，分布均匀，潮线清晰完整。 ② 模型组：软骨表面不光滑，出现多个裂隙及缺损，软骨结构分层不清，且细胞数量减少、分布不均匀，可见细胞簇集，潮线紊乱消失。③阳和汤组：软骨表面较光滑，软骨细胞比模型组排列整齐，软骨细胞增多，可见少量软骨细胞簇集现象，潮线较模型组清晰、完整。④筋骨痛消丸组：软骨表面光滑，细胞排列尚整齐，可见软骨细胞簇集现象，潮线清晰、完整程度较模型组好。

图2 光镜观察关节软骨病理显微结构（石蜡切片-HE 染色）（×100）Figure 2 Observation of pathological microstructure of articular cartilage by light microscopy（Paraffin-HE staining）（×100）

3.3 4 组关节软骨形态学改变Mankin’s 评分比较

见表2。

3.4 4 组血清及关节液中IL-1、TNF-α比较

见表3。

4 讨 论

4.1 阳和汤能有效修复骨关节炎的软骨损伤

骨关节炎以关节疼痛、肿胀、活动受限甚至关节畸形为临床症状，以关节软骨退变和继发性骨质增生为病理特点。 木瓜蛋白酶关节内注射动物模型与人类骨关节炎类似［9］，呈现出早期骨关节炎的病理改变。 本研究运用木瓜蛋白酶关节内注射法建立兔骨关节炎模型，采用苏木素-伊红染色方法在光镜下观察软骨组织，软骨形态学及Mankin's 评分结果显示，模型组的软骨表面出现多个裂隙及缺损，软骨结构分层不清，且细胞数量减少、分布不均匀，可见细胞簇集，潮线紊乱消失，与对照组比较Mankin's评分明显升高。 而经过阳和汤干预后，兔膝关节软骨形态及Mankin's 评分均明显改善，这表明阳和汤能有效修复骨关节炎的软骨损伤。

表2 4 组关节软骨形态学改变Mankin's 评分比较（）Table 2 Comparison of Mankin's score in morphological change of articular cartilage in four groups （）

表2 4 组关节软骨形态学改变Mankin's 评分比较（）Table 2 Comparison of Mankin's score in morphological change of articular cartilage in four groups （）

注：与对照组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。Note: Compared with the control group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

Mankin's 评分0.47±0.03 8.41±0.071）5.38±0.062）5.43±0.052）组别对照组模型组筋骨痛消丸组阳和汤组n 8 8 8 8

表 3 4 组血清及关节液中 IL-1、TNF-α 比较（）Table 3 Comparison of IL-1 and TNF-α in serum and articular fluid in four groups（）

表 3 4 组血清及关节液中 IL-1、TNF-α 比较（）Table 3 Comparison of IL-1 and TNF-α in serum and articular fluid in four groups（）

注：与对照组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。Note: Compared with the control group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

血清 关节液IL-1 55.06±1.02 86.27±1.271）67.30±1.482）64.67±1.072）组别对照组模型组筋骨痛消丸组阳和汤组n 8 8 8 8 TNF-α 71.22±0.68 92.39±0.611）66.29±0.712）69.26±0.392）IL-1 5.86±0.34 31.71±1.011）19.03±0.272）19.59±0.592）TNF-α 3.93±0.17 49.07±1.341）31.10±0.442）30.35±0.602）

中医学认为，骨关节炎属于“骨痹”范畴，“本”乃肝肾亏虚、正气不足，“标”乃风、寒、湿邪、血虚寒凝［10］。 因此，骨关节炎的治疗应遵循“急则治痹痛，缓则补肝肾、益气血”的原则，并随风寒湿痰随证加减［11］。 阳和汤方中熟地黄温补营血，鹿角胶温阳、益精血，二药合用，温阳补血；姜炭、肉桂药性辛热，共奏温阳散寒、温通血脉之功；白芥子辛温，可达皮里膜外，温化寒痰，通络散结；麻黄辛温达卫，宣通毛窍，开腠理，散寒凝；甘草解毒而调和诸药。 可见，阳和汤堪为攻补兼备、刚柔相济之治痹良方。

4.2 阳和汤能有效调控IL-1、TNF-α等炎性因子

骨关节炎以关节软骨破坏和骨重建为特征，其发病机制尚不明确，研究发现涉及多因素、多机制、多环节。其中，有研究显示IL-1、TNF-α 与骨关节炎关系密切［12-13］，这些炎性因子在骨关节炎患者中明显升高［14-15］，与骨关节炎的严重程度呈正相关［16-17］，是骨关节炎重要的致病因素，可多方位介导关节软骨退变，导致关节软骨破坏［18-19］。

本研究运用ELISA 法检测血清及关节液中IL-1、TNF-α 含量，结果表明模型组血清及关节液中IL-1、TNF-α 的表达与对照组比较明显升高，而阳和汤组血清及关节液中IL-1、TNF-α 的表达较模型组比较明显降低，这提示阳和汤能够调控IL-1、TNF-α 等炎性因子，促进骨关节炎患者损伤的软骨组织修复。

5 小 结

阳和汤可促进关节软骨修复，延缓关节软骨退变，其作用机制可能与抑制IL-1、TNF-α 这些炎性因子的表达有关。