壳三糖对H2O2诱导HaCaT细胞氧化应激损伤拮抗作用的研究

张静，王伟，毛相朝,3*

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院； 2.中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室，医药学院：山东 青岛 266003；3.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室，山东 青岛 266237)

壳寡糖又名甲壳胺，是甲壳质部分或全部脱乙酰化的产物，主要来自海洋甲壳动物外壳、昆虫及真菌细胞壁中的天然聚乙酰氨基葡萄糖[1]。由2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接成的壳聚糖，经降解得到不同聚合度的壳寡糖(chito-oligosaccharides，COSs)[2]。据报道壳寡糖具有生物相容性、抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性[3-5]。Wang等[6]发现琼胶寡糖可以清除羟基自由基、超氧阴离子，并推测琼胶寡糖的抗氧化性可能与聚合度密切相关。但已知聚合度的海洋低聚糖的抗氧化性分子机制研究较少。

发生氧化应激(oxidative stress，OS)是由于体内氧化/抗氧化系统作用失衡，倾向于氧化方向，进而产生有氧代谢的副产物活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，如超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢等物质[7-8]，体内ROS过量致使细胞质部分内容物外流，进而破坏细胞膜的通透性和完整性[9]。皮肤作为人体最大的器官，是机体的天然保护屏障，长期慢性氧化会对其造成严重的氧化损伤[2]。目前，用于治疗氧化损伤的药物主要是酮类、酚类物质[10-11]，但其生物相容性及细胞毒性等问题仍待解决。因此，开发高效低毒的抗氧化药物及功能性食品至关重要。本研究选取低聚壳三糖(结构见图1)为研究对象，研究其对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤的拮抗作用的主要途径及其分子机制，以期为以壳三糖为海洋来源新型抗氧化应激损伤的功能性食品或预防型药物提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株与化合物

人永生化角质形成细胞(HaCaT cell)(中国典型培养物保藏中心)在含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的MEM完全培养基中生长。聚合度为3的壳三糖(chitotriose hydrochloride，COS-3)购买自青岛博智汇力生物科技有限公司，即以虾蟹壳脱乙酰化后的壳聚糖为原料，利用凝胶过滤色谱法进行分离提纯，再通过质谱法等方法对结果进行分析[12]。

1.2 试剂与仪器

MEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(FBS)(依科赛生物科技有限公司)；青-链霉素、0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(杭州吉诺生物医药技术有限公司)； 4%多聚甲醛(上海源叶生物科技有限公司)；BSA干粉(北京索莱宝科技有限公司)；H2O2溶液、噻唑蓝溶液(MTT)和DCFH-DA粉末(美国Sigma-Aldrich公司)；总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western及IP细胞裂解液、RIPA细胞裂解液、上样缓冲液(Loading Buffer 5×)、蛋白酶抑制剂(PMSF)、BCIP-NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、SDS-PAGE电泳液干粉及半干法转膜液干粉(上海碧云天生物技术有限公司)；GAPDH和α-Tubulin单克隆抗体、羊抗兔p38和磷酸化p38(p-p38)单克隆抗体和Caspase 3单克隆抗体(美国CST公司)；羊抗兔IgG二抗(美国Santa Cruz公司)。其他试剂均为分析纯。

STERI-CYCLE 371二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；AMR-100全自动酶标分析仪(杭州奥盛仪器有限公司)；ESCO Class II B2生物安全柜(新加坡艺思高科技有限公司)；CP153C电子分析天平(美国OHAUS公司)；CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司)；GL-150B干式恒温加热器(海门Kylin-Bell仪器制造有限公司)；DMI 6000B荧光显微镜(德国Leica公司)；半干转膜仪、垂直蛋白电泳仪(美国Bio Rad公司)。

1.3 MTT法检测COS-3对HaCaT细胞的细胞毒性

取对数生长期生长到80%的HaCaT细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，在5%CO2的37 ℃培养箱中培养24 h，每组设置3个平行孔(n=3)。化合物组分别加入20 μL终浓度为31.25、62.50、125.00和250.00 μg/mL的COS-3溶液，在培养箱中孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸弃上清后向每个孔中加入150 μL DMSO溶液，37 ℃摇床振荡10 min将甲瓒完全溶解，酶标仪在540 nm波长下测定吸光值(OD)[13]。细胞存活率以对照组的百分比表示。

1.4 H2O2氧化应激损伤模型的建立

取对数生长期生长到80%的HaCaT细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，在5%CO2的37 ℃培养箱中培养24 h，每组设置3个平行孔(n=3)。向各孔中加入20 μL不同终浓度(100、200、300、400和500 μmol/L)的H2O2溶液孵育12 h，孵育结束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸弃上清后向每个孔中加入150 μL DMSO溶液，37 ℃摇床振荡10 min，酶标仪在540 nm波长下测定OD值。细胞存活率以对照组的百分比表示。

1.5 COS-3抗H2O2诱导HaCaT细胞氧化损伤活性的筛选

取对数生长期生长到80%的HaCaT细胞接种于96孔板，每组设置3个平行孔(n=3)。将细胞随机分为空白对照组(正常培养细胞)、损伤组(H2O2诱导的细胞)和化合物组(COS-3预处理的H2O2诱导损伤的细胞)。化合物组分别加入20 μL终浓度为31.25、62.50、125.00和250.00 μg/mL的COS-3溶液孵育12 h，再向损伤组和化合物组各孔中加入20 μL H2O2(300 μmol/L)溶液孵育12 h，孵育结束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸弃上清后向每个孔中加入150 μL DMSO溶液，37 ℃摇床振荡10 min，酶标仪在540 nm波长下测定OD值。细胞存活率以对照组的百分比表示。

1.6 DCFH-DA法测定ROS的含量

取对数生长期生长到80%的HaCaT细胞，以3×105个/孔接种于6孔板，在5%CO2的37 ℃培养箱中培养24 h。各实验组的设置同1.5，每组设置3个平行孔(n=3)。孵育后吸弃培养基，加入1 mL稀释好的20 μmol/L DCFH-DA溶液于37 ℃细胞培养箱内避光孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，荧光显微镜观察荧光强度，激发和发射波长分别为488 nm和525 nm[14]。使用Image-J软件对荧光图进行定量分析，结果以对照组的百分比表示。

1.7 ELISA 法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量

培养对数生长期的HaCaT细胞接种于96孔板，各实验组的设置同1.5，每组设置3个平行孔(n=3)。收集上清液通过乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒用于LDH释放量的检测。用Western及IP裂解液裂解细胞，重悬并在冷PBS缓冲液中匀浆，离心后收集的上清液根据总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)用于SOD含量的检测，SOD和LDH的检测波长分别为450 nm和490 nm[15]。所有数据均以空白对照组的百分比表示。

1.8 Western blot法检测p38MAPK信号通路和Caspase3凋亡蛋白的表达量

培养对数生长期的HaCaT细胞接种于6孔板，各实验组的设置同1.5，孵育结束后吸弃培养基，向各孔中均匀加入100 μL的裂解液(80 μL RIPA+20 μL 5×Loading Buffer+1 μL PMSF)，冰上裂解10 min后，细胞刮刮下细胞，置于100 ℃干式恒温加热器中煮沸15 min收集蛋白样品。用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，使蛋白样品上样体积相同时对应的内参蛋白(GAPDH和α-Tubulin)浓度保持一致。通过SDS-PAGE分离蛋白后，半干转50 min转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，用5% BSA(2.5 g BSA干粉+50 mL TBS-T缓冲液)溶液4 ℃封阻16 h。随后将NC膜用对应特异性蛋白质的不同一抗(Caspase-3、p-p38、p38、GAPDH和α-Tubulin，1∶1 000)在37 ℃摇床100 r/min孵育2 h，用含0.05%Tween-20的Tris(TBS-T)缓冲液洗涤细胞3次，再加入相关二抗(1∶5 000)在37 ℃摇床100 r/min孵育1.5 h。用TBS-T缓冲液洗3次，通过BCIP/NBT碱性磷酸酶显色液显色5～10 min[16]。对目的条带拍照，再通过Image-J软件对蛋白质条带进行定量分析，结果均以空白对照组的倍数表示。

1.9 统计学方法

所有实验数据均以(平均值±标准差)表示，用SPSS软件对数据进行统计学分析，采用One-Way ANOVA分析比较各组间数据差异的显著度。其中，“△”表示H2O2损伤组与对照组之间的比较，“*”表示COS-3化合物组与H2O2损伤组之间的比较。0.01<△(*)P<0.05，表明具有统计学差异；0.001<△△(**)P<0.01，表明具有显著统计学差异；△△△(***)P<0.001，表明具有极其显著统计学差异。

2 结果

2.1 COS-3对H2O2诱导HaCaT细胞氧化应激损伤的抑制作用

通过薄层色谱分析得到COS-3(相对分子质量：501.23)纯度达到97%，质谱图如图2A所示(ESI-MS质谱图结果由青岛博智汇力生物科技有限公司提供)。采用MTT法测得不同浓度的COS-3(200、400、600、800和1 000 μg/mL)预处理的HaCaT细胞活力不低于94%(图2B)，证明COS-3几乎无细胞毒性，不影响后续实验的结果。H2O2最佳造模浓度为300 μmol/L，细胞存活率为(44.6±5.9)%(图2C)。4种浓度的COS-3对H2O2诱导HaCaT细胞氧化损伤均有不同程度的抑制作用，125.00和250.00 μg/mL的COS-3预处理组可将受损细胞活力分别提高至(67.5±5.9)%和(73.2±3.4)%(P<0.01)，31.25 μg/mL和62.50 μg/mL的COS-3预处理组也可以提高细胞存活率，但没有显著性，结果见图2D。

2.2 COS-3对H2O2诱导HaCaT细胞内ROS含量的影响

荧光显微镜观察结果见图3A，H2O2损伤组细胞内荧光强度明显增强，而COS-3预处理组荧光强度随着浓度的升高呈浓度依赖性减弱。通过Image-J软件分析可知，损伤组细胞内ROS含量升高至对照组的(407.9±12.8)%。COS-3预处理组细胞内ROS含量分别降至对照组的(300.3±15.0)%、(260.1±9.6)%、(169.3±8.0)%和(144.5±8.2)%(P<0.001)(图3B)。结果说明H2O2诱导会使HaCaT细胞处于氧化应激状态，直接表现为ROS含量的上升，而COS-3可以通过抑制受损细胞内ROS含量的产生与积累，从根源上对H2O2诱导HaCaT细胞氧化损伤起到拮抗作用。

2.3 COS-3对H2O2诱导HaCaT细胞内SOD含量及LDH释放量的影响

损伤组细胞内的SOD酶活力降低至对照组的(71.0±4.9)%，LDH释放量升高至对照组的(810.5±90.4)%，但125.00 μg/mL和250.00 μg/mL COS-3预处理组细胞内SOD的活性提高至对照组的(88.9±6.0)%、(91.6±8.9)%(P<0.05)，31.25 μg/mL和62.50 μg/mL COS-3预处理组也可以提高SOD的酶活力，但是没有显著性差异(图4A)。62.50、125.00和250.00 μg/mL COS-3预处理组细胞内LDH释放量降低至对照组的(458.0±11.9)%、(374.7±45.4)%及(252.6±65.0)%(P< 0.01)，31.25 μg/mL COS-3预处理组也可降低LDH释放量，但无显著性差异(图4B)。ELISA结果表明，COS-3能有效提高受损细胞内SOD的酶活力并减少LDH释放量，从而通过维持抗氧化系统的平衡和细胞膜的完整性，达到抗氧化损伤的保护效果。

2.4 COS-3对H2O2诱导HaCaT细胞内p38MAPK和Caspase3表达水平的调控

损伤组细胞内磷酸化的p38(p-p38)和Caspase3表达量均显著升高，COS-3预处理组以浓度依赖效应下调2种蛋白的表达量，结果见图5A和图5C。Image-J定量分析表明损伤组细胞内p-p38和Caspase3分别为对照组的2.7和1.9倍，31.25、62.50、125.00 和250.00 μg/mL COS-3预处理组p-p38的表达量降至对照组的2.0、1.8、1.3和1.3倍(P< 0.001)(图5B)，但COS-3对p38表达量没有明显影响；125.00 μg/mL和250.00 μg/mL COS-3预处理组Caspase3的表达量降至对照组的1.5和1.2倍(P< 0.01)，31.25 μg/mL和62.50 μg/mL COS-3预处理组也可降低Caspase3表达量，但无显著性差异(图5D)。Western Blot结果说明，COS-3可以通过降低p38MAPK信号通路的异常激活及凋亡蛋白Caspase-3的活化以抑制细胞凋亡。

3 讨论

H2O2是体内活性氧簇的主要组成成分之一，参与皮肤的慢性氧化过程，如皮肤衰老、色斑等疾病[17]。本研究结果表明，COS-3预处理组呈浓度依赖效应地提高H2O2诱导的HaCaT细胞的存活率。COS-3可以降低细胞内ROS含量，增强SOD活性以及减少LDH释放量，表明COS-3可以抑制受损细胞内抗氧化系统的破坏程度，确保细胞膜的完整性以防止细胞内容物的外泄。同时，COS-3也下调了MAPKs家族p38磷酸化的异常激活和促线粒体凋亡蛋白Caspase3的表达，由于p38MAPK信号通路的激活会诱发线粒体功能障碍促使Caspase3蛋白的表达从而促使细胞凋亡[16]，因此证实了COS-3可以通过抑制线粒体凋亡通路的激活来保护氧化应激受损细胞。本研究表明，COS-3可以通过调节抗氧化系统的平衡以及线粒体凋亡通路的异常激活，从而对HaCaT细胞的氧化应激损伤表现出拮抗保护作用。

壳寡糖作为虾蟹壳副产物来源的新型功能性已知聚合度的低聚糖，具有可生物降解、毒副作用小且获取、摄入均十分方便和安全的特点[18-19]，因此可作为食品添加剂、保健品，也可用于预防及治疗疾病等方面。本实验明确了已知聚合度的壳三糖抗氧化应激损伤的具体保护作用途径及其分子调控机制。因此，COS-3值得进行进一步体内研究，将COS-3的抗氧化应激损伤及其分子机制在小鼠体内实验中进行验证，且本研究进展将为氧化应激相关疾病的预防和治疗开辟新途径。