枸杞多糖对肝纤维化大鼠的免疫调节作用

张志涛，韩艳珍，单铁英，周 燕，刘海平，储 媛，牛双英，贾小燕

(1.邯郸市传染病医院，河北 邯郸056002；2.河北工程大学附属医院；3.河北工程大学医学院 a.组织学与胚胎学；b.护理学；4.邯郸市中心医院；5.五矿邯邢职工总医院)

肝硬化是以细胞外基质(ECM)过度增生与异常沉积为特征[1]。肝纤维化在中医理论上属气滞血瘀之病变[2]。中药枸杞子归肝经，研究表明，枸杞子的有效成分枸杞多糖(LBP)能够保护脾脏、胸腺等免疫器官具有免疫调节作用和保肝作用[3,4]。本研究主要通过制备肝纤维化大鼠模型，观察IL-1、IL-6、IL-10、TNF-a等细胞因子水平的变化和大鼠肝组织中羟脯氨酸含量的变化，探讨LBP对大鼠肝纤维化进程的免疫调节作用。

1 资料与方法

1.1 实验资料

1.1.1肝纤维化大鼠模型的建立及分组 健康的Wistar大鼠18只，5-6月龄，体重200 g-280 g，采用随机方法分为对照组、模型组和治疗组各6只。模型组和治疗组：采用用四氯化碳(CCl4)腹腔注射的方法制备大鼠肝纤维化模型。CCl4用橄榄油按25%容积分数配成油剂溶液。将大鼠给予2 μl/g体质量CCl4橄榄油溶液腹腔注射，每3日1次，共注射12次，制备肝纤维化模型。对照组：大鼠只给予相同剂量和次数的橄榄油溶剂腹腔注射。

1.1.2各组采用不同的处理方法 治疗组：大鼠经LBP灌胃治疗，以30 μg/g体质量灌胃LBP，每天1次，共15天；对照组和模型组：大鼠给予等剂量的生理盐水灌胃，每天1次，共15天。

1.2 检测方法

1.2.1用ELISA法检测各组大鼠外周血中 IL-1、IL-6、IL-10、TNF-a等细胞因子水平的变化。

1.2.2大鼠肝组织切片经H&E、天狼猩红和masson三色染色法观察其组织病理学变化，用比色法测定各组肝组织中的羟铺氨酸的含量。

1.3 统计分析

数据采用 SPSS22.0 软件进行统计分析，计量资料服从正态分布的采用均数±标准差表示，多组间计量资料比较服从正态分布且方差齐时采用方差分析，两两比较采用 LSD 法。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分组的相关指标比较治疗组、模型组和对照组的 IL-1、IL-6、IL-10 和 TNF-α 情况如表 1 所示。比较显示三组间的 IL-1、IL-6、IL-10 和 TNF-α 差异均有统计学意义(P<0.05)。进一步两两比较显示，模型组的 IL-1、IL-6 和 TNF-α 均高于治疗组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，治疗组的 IL-1、IL-6 和 TNF-α 均高于对照组，但差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组的 IL-10 均低于治疗组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，治疗组的 IL-10 低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。实验组与对照组大鼠外周血中 IL-1、IL-6、IL-10、TNF-a细胞因子水平的变化见表1。

表1 3组大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-10、TNF-a细胞因子含量的比较

2.2 实验组与对照组大鼠肝组织中的羟铺氨酸的含量见表2。

表2 3组大鼠肝组织中羟铺氨酸的含量的比较

3 讨论

枸杞多糖是由宁夏枸杞的干燥成熟果实经脱脂、水提反复醇沉所得。LBP由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6种单糖组成，是含多种微量元素和氨基酸的蛋白杂多糖[5]。近年来研究证明LBP能够提高大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，从而增强机体的免疫功能[6]。

ECM是肝硬化的早期阶段和必经阶段，在一定情况下可被逆转，但若病因持续存在，肝纤维化逐渐加重，肝小叶及血管等逐渐被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，假小叶形成即发展为肝硬化[7-9]。目前虽有许多药物用于护肝治疗，但尚缺特效的防治手段。在肝纤维化进展过程中,多种免疫细胞通过合成分泌不同的细胞因子、趋化因子等化学介质,介导免疫炎症反应[1,10,11]。同时,免疫细胞与细胞因子构成影响肝组织及细胞的免疫微环境,微环境中的各因素相互作用、相互制约,形成复杂的网络体系,共同影响肝纤维化的进程[12,13]。

本实验研究了LBP对肝纤维化进程中外周血巨噬细胞细胞因子的影响,结果显示服用LBP的大鼠体内细胞因子IL-1、IL-6、TNF-a的水平显著降低，IL-10水平升高。提示LBP是通过激活巨噬细胞抑制IL-1、IL-6、TNF-a的产生而发挥免疫作用的。IL-1、IL-6、TNF-a是主要的促炎因子，IL-10是主要的负反馈调节因子，在控制局部炎症时对肝脏起保护作用，并通过抑制炎性介质的释放阻止肝纤维化的发生、发展[14]。LBP增强免疫作用可能机制有:在肝脏调节肝细胞的微环境，广泛抑制细胞因子IL-1、IL-6、TNF-a，并刺激IL-10的产生，维持体内免疫反应的平衡和稳定，对血管生成和细胞的凋亡起到促进作用，从而对肝细胞纤维化进程起到抑制作用。但目前LBP发挥免疫调节的具体机制还不清楚。

测定肝脏组织的羟脯氨酸含量，也是反映肝脏纤维化程度的敏感指标之一。羟脯氨酸是机体胶原蛋白的主要成分之一，约占氨基酸总量的13%，是构成结缔组织中胶原纤维的主要成分，是结缔组织分解情况的指标，体内胶原蛋白代谢与肝纤维化密切相关。羟脯氨酸含量与肝纤维化的程度呈正相关[15]。本实验大鼠肝组织中羟脯氨酸含量在服用LBP后有了明显的下降。LBP能调节免疫过程增强免疫功能，在肝脏羟脯氨酸代谢中起到积极作用，在引起肝纤维化的慢性肝损伤中增加了胶原蛋白肽链的分解，从而抑制了肝纤维化的进程。如果能用LBP总体调节肝脏的免疫微环境,诱导免疫细胞向逆转肝纤维化的功能方向发展,可能成为治疗肝纤维化的一种新思路。

细胞因子在体内的相互作用、淋巴细胞亚群之间的协作，受到细胞周围环境的影响，LBP调节机体免疫功能可能与抑制炎性作用、稳定肝细胞的内环境，提高了免疫能力有关。实验虽然证实LBP在肝纤维化进程中的免疫调节作用，但是具体的调节机制及在淋巴细胞之间的免疫平衡之间的作用机理还不清楚，需要进一步实验证实。