血清学试验与FUT1基因测序鉴定类孟买血型OHmA

郭淦平,吴远军*,姬艳丽,李见群,吴树杰,温妙珍

(1.东莞市妇幼保健院 输血科，广东 东莞523120；2.广州血液中心临床输血研究所，广东 广州510095)

类孟买血型是由于位于19q13.3的FUT1 基因突变，导致H抗原合成障碍，表现为红细胞H抗原部分缺失的一种罕见血型。类孟买血型个体血浆中可存在抗-H，不相容输血可能引起溶血性输血不良反应，因此准确鉴定类孟买血型具有重要的临床意义。我们对常规ABO血型鉴定中遇到的1例ABO血型正反定型不相符的就诊者，通过血清学试验和PCR-SSP 法FUT1基因测序证实其为类孟买血型OHmA，报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

就诊者，女，24岁，停经1个半月，自测绒毛膜促性腺激素(HCG)阳性，就诊要求终止妊娠。B超提示宫内早孕。在常规ABO血型鉴定时发现正反定型不符，而进行ABO、H和Lewis血型鉴定相关的血清学试验，并进行PCR-SSP 法FUT1基因测序。

1.2 仪器与试剂

血型血清学专用离心机(KUBOTA，KA2200)，单克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-Lea、抗-Leb和A、B、O型标准红细胞(均为上海血液生物医药有限公司生产)，单克隆抗-AB，抗-H(LORNE 实验室有限公司生产)。

1.3 方法

1.3.1用单克隆抗体试剂和标准红细胞检测红细胞血型抗原和抗体 取试管12支，分别标识为“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-H(对照)”、“抗-Lea”、“抗-Leb”、“Ac”、“Bc”、“Oc”、“自身c”；在标识为“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-H对照”、“抗-Lea”、“抗-Leb”的8支试管中分别加入相应单克隆抗体试剂100 μl，在标识为“Ac”、“Bc”、“Oc”、“自身c”的4支试管中分别加入受检者血浆100 μl；再在标识为“抗-A”、“抗-A1”、“抗-AB”、“抗-B”、“抗-H”、“抗-Lea”、“抗-Leb”的7支试管中各加入浓度为3%-5%的受检者红细胞悬液50 μl，在标识为“抗-H对照”的试管中加入浓度为3%-5%的O型标准红细胞悬液50 μl，在标识为“Ac”、“Bc”、“Oc”的3支试管中分别加入浓度为3%-5%的A、B、O型标准红细胞悬液50 μl，在标识为“自身c”的试管中加入浓度为3%-5%受检者红细胞悬液50 μl。将12支试管内反应物混匀后，用血型血清学专用离心机120 g离心1 min，肉眼和显微镜下观察凝集情况。

1.3.2吸收放散试验检测红细胞弱表达的ABO血型抗原 取5人份B型血浆(各1 ml)混合后吸取2 ml，与受检者压积红细胞1 ml混合，置于4℃吸收4 h(每30 min混匀一次)，离心分离上清液，将压积红细胞用4℃生理盐水连续洗涤4次，留取最后一次洗涤液与A型标准红细胞反应以判定洗涤效果。在洗涤后的压积红细胞中加等容量生理盐水，置56℃放散10 min，56℃保温离心后吸取上清液(放散液)。取试管4支，分别标识为“放+Ac”、“放+Bc”、“放+Oc”、“洗+Ac”，在标识为“放+Ac”、“放+Bc”、“放+Oc”的3支试管中各加入放散液100 μl，并分别加入浓度为3%-5%的A、B、O型标准红细胞悬液50 μl；在标识为“洗+Ac”的试管中加入最后一次洗液100 μl和浓度为3%-5%的A型标准红细胞悬液50 μl。将4支试管内反应物混匀后用血型血清学专用离心机120 g离心1 min，肉眼和显微镜下观察凝集情况。

1.3.3FUT1基因测序 采用PCR方法扩增FUT1基因的编码区域全长，扩增引物、体系及反应条件参照文献[1]进行。PCR扩增产物直接送专业的生物技术公司进行后续纯化和Sanger测序(广州天一辉远基因科技有限公司，广州)。测序结果用DNASTAR软件与FUT1基因标准序列(NC_000019.9)进行比对，对碱基变异进行鉴定。

2 结果

2.1 单克隆抗体试剂和标准红细胞检测红细胞血型抗原和抗体结果

受检者红细胞与单克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-Lea、抗-H反应均为阴性，与单克隆抗-Leb反应为3+，O型标准红细胞与单克隆抗-H反应(阳性对照)为2+；受检血浆与A型标准红细胞反应为±，与B型标准红细胞反应为4+，与O型标准红细胞反应为1+，表明受检者血浆中存在较强的抗-B和较弱的抗-H，见表1。

表1 单克隆抗体试剂和标准红细胞检测红细胞血型抗原和抗体结果

2.2 吸收放散试验结果

受检者红细胞与B型人血浆的吸收放散液，与A型标准红细胞反应为1+，与B型和O标准红细胞反应为阴性。最后一次洗涤液与A型标准红细胞反应为阴性，表明受检者红细胞弱表达A抗原，不表达B抗原，见表2。

表2 吸收放散液检测结果

2.3FUT1基因测序结果

FUT1基因测序检出c.658C>T纯合突变(以往将携带有该突变的等位基因命名为h3等位基因，即本例样本基因型为h3h3)。该突变导致FUT1编码的α1,2-岩藻糖基转移酶第220位精氨酸(Arg)突变为丝氨酸(Cys)，即 p.220Arg>Cys，见图1。

图1 FUT1基因测序结果

3 讨论

红细胞H抗原是国际输血协会(ISBT)确认并编号为018的红细胞H血型系统中唯一的抗原。ABH血型物质的表达与ABO、H、Lewis血型系统密切相关，前体物质都是多糖R，受ABO、FUT1(H)、FUT3(LE)、FUT2(Se)这4个座位基因控制，ABO、FUT1、FUT3、FUT2的基因产物都是糖基转移酶。ABO编码A、B糖基转移酶，控制ABO血型系统抗原表达；FUT1编码α1,2-岩藻糖基转移酶，控制H抗原表达；FUT3编码Lewis转移酶，控制Lewis血型系统抗原表达；FUT2 控制ABH分泌型，其Se为ABH分泌型，se为ABH非分泌型，SeW为ABH部分分泌型[2]。

FUT1基因有两个等位基因H和h，H等位基因编码的α1,2-岩藻糖基转移酶使岩藻糖与前身物质多糖R糖链末端的半乳糖相连形成H抗原。而H抗原又是A、B抗原的前身物质，在A、B基因编码的A、B糖基转移酶作用下分别转化为A、B血型抗原。h等位基因不能编码具有活性的岩藻糖转移酶，hh纯合子个体红细胞上和分泌液中均无H、A、B抗原，血浆中有抗-H，是非常罕见的孟买血型(Bombay)。当FUT1基因缺陷而FUT2基因正常或弱表达时可表现为红细胞上具有很少量或没有H、A、B抗原，分泌液中含有正常量的H、A、B血型物质，即为类孟买血型(Para-Bombay)。类孟买型个体血浆中也可存在抗-H[3]。目前报道的与H抗原缺陷相关的FUTl等位基因有50余种[4]，在我国最常见的是h1、h2和h3等位基因，突变点分别是FUTI547delAG、FUTl880delTT和FUTl658C>T[5,6]。

现已明确，红细胞不能合成Lewis血型系统的Lea和Leb抗原，红细胞膜的Lea和Leb抗原是从血浆中吸附的Lea和Leb血型物质，而血浆中的Lea受FUT3(LE)控制，Leb受LE和Se(分泌基因)共同控制。由于ABH分泌型个体FUT2基因型为Se/Se或Se/se，Lewis血型表现为Le(a-b+)或Le(a-b-)，而不会表现为Le(a+b-)[7]。

本例就诊者红细胞与单克隆抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H反应均为阴性，血浆与标准红细胞反应的凝集强度分别为A型±、B型4+、O型1+，红细胞吸收放散液(与B型人血浆做吸收试验)与标准A型红细胞反应为+，与B型和O型红细胞反应均为阴性，Lewis血型为Le(a-b+)，符合类孟买血型OHmA(红细胞未检出H、B抗原，检出弱表达的A抗原，血浆中检出较弱抗-H和较强抗-B，根据Lewis血型可推测其为分泌型)。FUT1基因测序检出我国常见的c.658C >T纯合突变，从分子水平证实本例就诊者为类孟买血型。

类孟买血型个体血浆中可存在抗-H，并由于作为ABO血型抗原前体物质的H抗原缺陷，导致正常A、B基因的个体红细胞不能表达正常的A、B抗原。从而导致ABO血型鉴定正定型红细胞与单克隆抗-A、抗-B反应无凝集，反定型可由于抗-H的存在而与A、B型红细胞凝集(凝集强度一般较正常O型人弱)，表现为类似O型的反应格局，容易将类孟买血型误定为“O”型。如类孟买血型个体血浆不存在抗-H，则ABO血型鉴定表现为正反定型反应格局不相符。因此，在常规鉴定ABO血型时应采用正反定型，反定型应使受检者血浆(血清)与A、B、O型标准红细胞反应，对正定型红细胞与单克隆抗-A、抗-B反应无凝集，正反定型不符或反定型与O型标准红细胞有凝集者(先排除抗-H以外的红细胞不规则抗体)，应进行类孟买血型的血清学鉴定，必要时应进行FUT1基因测序，以避免漏检类孟买血型。

抗-H是具有临床意义的红细胞抗体，不相容输血可引起免疫溶血性输血反应，通常认为类孟买血型患者在需要输血时最好输用相同H抗原缺乏血型的血液[8]。但由于类孟买血型是非常稀有的血型，其频率在不同人群中存在差异，泰国为1/5 000，台湾为1/8 000，香港为1/15 620，我国大陆目前还没有进行大量样本的调查，仅在某些地区和民族较高，如福建地区频率约为1/8 500，而云南少数民族拉祜族中的频率高达2.2%[9]。当临床发现类孟买血型患者需要输血治疗时很难找到相合供者，对其家系，尤其是同胞兄妹间进行血型血清学调查，是寻找相合供者的重要途径。在无法找到相同H抗原缺乏血型血液时,应根据血型血清学试验检测患者抗-A、抗-B、抗-H 的实际情况，选择37℃与患者血清反应最弱的ABO 血型进行输血治疗[8,10-12]。