人乳头瘤病毒(HPV)型别与SOX1和PAX1基因甲基化的相关性研究

王文杰,余敏红,范世珍,周新荣,于波海*

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨150001;2.黑龙江省大庆市人民医院;3.广州中医药大学深圳医院)

宫颈癌是全球严重威胁妇女健康的第四大恶性肿瘤。2012年，全世界宫颈癌新增病例约为528 000例，宫颈癌死亡人数为266 000人[1]。人乳头瘤病毒(HPV)感染是导致宫颈癌的重要危险因素，其中99.0%的宫颈癌与HPV感染有关。目前已鉴定出100多种人乳头瘤病毒类型。根据其致癌能力可分为高风险和低风险两类。hrHPV包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和82[2]。约71%的宫颈癌与HPV16和HPV18感染有关。HPV的患病率和类型具有种族差异，在亚洲，HPV52和HPV58的感染更为常见[3]。hrHPV感染被认为是宫颈癌及其前体病变的主要危险因素[4]。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰方式之一，参与到基因调控过程中。DNA甲基化异常是导致肿瘤抑制基因功能失活和转录抑制的关键机制之一。DNA甲基化变化的积累与疾病的严重程度有关。PAX1隶属于配对盒基因家族，是一种重要的转录调控因子，PAX1通过调控细胞增殖，诱导细胞定向迁移等参与胚胎发育过程中重要器官的形成。性别决定区域 Y1(sexdeterming region Y-box1,SOX1)是编码 SOX 家族转录因子中的一个成员，具有参与胚胎发育的调节以及决定细胞存亡的功能。研究表明，SOX1和PAX1基因基因启动子区域甲基化普遍存在于中国女性宫颈癌患者中，在宫颈癌前病变阶段，该基因启动子甲基化是早期事件，宫颈癌组织中的甲基化显著的高于正常组织，能够将进展为癌前病变的高危人群和正常人群加以区分，所以可作为宫颈癌早期诊断的特异性甲基化分子标志物[5，6]。

国内外已有研究表明SOX1和PAX1基因启动子甲基化有望成为新型的检测宫颈癌的分子生物标志物。本研究检测SOX1和PAX1基因启动子甲基化在感染不同风险HPV型别的患者中检出率，探究SOX1和PAX1基因启动子甲基化和不同风险HPV型别的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象及标本采集

本研究获得广州中医药大学深圳医院(福田)伦理委员会的批准。研究对象为宫颈细胞学异常和/或宫颈HPV异常，需要阴道镜进一步检查的患者，且无子宫切除史，孕妇以及有泌尿系统肿瘤或泌尿系统感染的患者不纳入本试验。本次研究共收集宫颈脱落细胞样本例数为324例。在妇科检查室，患者在阴道镜检查前，医生使用凯普公司的宫颈细胞采样刷采集宫颈脱落细胞标本，并将取样刷放入配套保存液中(粤潮械备20150018号)。

1.2 标本处理

将样本转移至1.5 ml离心管中，采用凯普的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170053号)提取宫颈脱落细胞标本的DNA，按试剂盒说明书提供的方法操作。以上提取的DNA保存在-15℃以下。

1.3 HPV检测

所有样本的HPV检测采用凯普37种人乳头状瘤病毒分型检测试剂盒(PCR+导流杂交法)，共可以检测37种HPV基因型(HPV6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、84)，其中HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68为14种HPV高危型别。

1.4 亚硫酸盐修饰法

采用凯普的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20181080号)对提取样本DNA进行亚硫酸盐转化处理(模板DNA的浓度不低于200 ng)，按试剂盒说明书提供的方法操作。以上亚硫酸盐修饰后的DNA保存在-15℃以下。

1.5 甲基化特异性聚合链反应

反应体系共20 μl，主要包括：2 × PCR reaction mix(promega，M5122)10 μl；SOX1基因上、下游引物各0.5 μl；PAX1基因上、下游引物各0.5 μl；内参基因ACTB基因上、下游引物0.5 μl；SOX1基因、PAX1基因和内参基因ACTB的探针各0.4 μl；纯水3.4 μl；DNA聚合酶0.5 μl；模板(亚硫酸氢盐修饰 DNA)1 μl。PCR反应条件为：95℃预变性10 min；然后95℃变性20 s，60℃退火及延伸30 s，共进行45个循环。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV型别与SOX1和PAX1基因甲基化检出率的相关性

不同HPV型别中SOX1和PAX1基因甲基化检出率如表1所示。由结果可知，在感染最高风险致癌型别HPV16/18患者中，SOX1和PAX1基因甲基化检出率最高为54.9%；其次是感染非16/18 hrHPV患者中SOX1和PAX1基因甲基化检出率为24.0%；在感染其他型别HPV患者中SOX1和PAX1基因甲基化检出率为11.1%；在HPV检测阴性患者中SOX1和PAX1基因甲基化检出率为2.2%。

表1 感染不同HPV型别患者中SOX1和PAX1基因甲基化检出率

2.2 HPV16/18阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率

HPV16/18阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率如表2所示。由结果可知，HPV16/18阳性的CIN3+患者的甲基化检出率为86.0%，HPV16/18阳性的CIN2患者的甲基化检出率为35%，HPV16/18阳性的病理正常/CIN1患者的甲基化检出率为14.3%。

表2 HPV16/18阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率

2.3 非HPV16/18 hrHPV阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率

非HPV16/18 hrHPV阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率如表3所示。由结果可知，非HPV16/18 hrHPV阳性的CIN3+患者的甲基化检出率为80.0%，非HPV16/18 hrHPV阳性的CIN2患者的甲基化检出率为37%，非HPV16/18 hrHPV阳性的病理正常/CIN1患者的甲基化检出率为5.3%。

表3 非HPV16/18 hrHPV阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率

2.4 其他HPV型别阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率

其他HPV型别阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率如表4所示。由结果可知，CIN3+的患者中未发现仅感染除14种hrHPV的其他HPV型别，而其他HPV型别阳性的CIN2患者的甲基化检出率为33.3%，非其他HPV型别阳性的病理正常/CIN1患者的甲基化检出率为6.7%。

表4 其他HPV型别阳性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率

2.5 HPV检测阴性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率

HPV检测阴性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率如表5所示。由结果可知，在病理正常/CIN1患者的甲基化检出率为97.4%。存在5例CIN2的患者HPV检测和甲基化检测结果皆为阴性，1例CIN3+的患者HPV检测和甲基化检测结果皆为阴性。

表5 HPV检测阴性的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率

3 讨论

高危型HPV的持续性感染是导致宫颈癌的主要因素已得到公认，所以以HPV为基础的检测技术广泛应用于宫颈癌筛查。研究表明，不同hrHPV基因型别具有不同致病风险。在世界范围内，大约70%的宫颈癌是由于HPV16和18持续性感染导致的。由于大部分HPV感染是一过性感染，在12个月内90%的HPV感染能够通过自身机体的免疫力自动清除，而HPV DNA检测无法区别一过性感染和持续性感染，所以HPV DNA检测的灵敏度较高，特异性较低。所以很多患者虽然HPV DNA检测为阳性，但并未发生有临床意义的宫颈病变。

特异性基因甲基化检测是一种新的癌症筛查策略，一个最佳的生物标志物将有助于早期发现癌症。研究发现PAX1、SOX1、ZNF582以及POU4F3等宫颈癌特异性甲基化基因在检测CIN3+样本具有较好的表现，宿主基因甲基化检测CIN2或CIN3的敏感性在69%-74%之间，特异性在66%-82%之间显示了其临床价值[3,5-7]。

在本研究中，感染不同风险HPV型别的患者的甲基化水平也是不一致的，随HPV型别风险的增大，其甲基化水平也是增加的。在感染高危型HPV16/18的患者的甲基化水平明显高于其他12中高危HPV型别和其他低危HPV型别；HPV16/18阳性下SOX1和PAX1基因在病理阴性/CIN1的患者中的甲基化检出率仅为14.3%。无论在HPV16/18阳性、非HPV16/18 hrHPV阳性或者其他型别HPV阳性下的不同级别宫颈病变者的甲基化检出率也是随病变级别的加深而增大。DNA甲基化是抑制外来DNA和病毒基因组入侵的一种常见的细胞防御机制。STEENBERGEN等人研究发现高危型HPV持续性感染是导致宫颈癌及癌前病变的主要因素，且hr-HPV还能诱导宿主细胞发生遗传及表观遗传学的改变导致癌变[8]。所以在感染高风险HPV型别的患者的甲基化水平是明显高于低风险HPV型别的患者，尤其是HPV16和/或18中。按照ASCCP在2014年制定的子宫颈癌筛查中期指南，建议HPV16和/或18阳性者可直接转诊阴道镜，而其他高危型别阳性者需根据细胞学而定，细胞学异常者直接转诊阴道镜，无异常者则1年后随访。如何利用特异性的分子标志物将高度病变的人群识别，避免低风险人群不必要的转诊导致过度诊疗，对HPV阳性人群的分流管理是HPV检测作为初筛要面临的棘手问题。将宿主基因甲基化分析与人乳头瘤病毒基因检测相结合似乎是宫颈癌筛查的一种新策略。宿主基因良好的特异性可以提高HPV阳性女性宫颈异常检测的准确性。