LMP-1重组质粒对过敏性鼻炎动物模型RAGE，HMGB1及TSLP表达的影响

丛贾囡，郑庆范，朱学伟*，段伟娜,3，杨寿君

(1.长春市中心医院 眼科，吉林 长春130062；2.吉林大学中日联谊医院;3.内蒙古医科大学基础医学院)

变应性鼻炎(过敏性鼻炎，AR)的发病率不断增高[1-3]，环境及病毒感染等成为重要的相关影响因素[4-6]。研究显示，包括EB病毒(EBv)以及鼻病毒等因素可能参与变应性鼻炎及哮喘的调节，可能通过促进Th2方向IL-4以及IL-13等细胞因子的表达，参与到变应性鼻炎以及哮喘的发生、发展进程中[7]。EB 病毒主要特征基因潜伏膜蛋白1(LMP1)转染后鼻咽癌细胞能够促进其高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达,鼻黏膜局部释放的HMGB1可以促进嗜酸性粒细胞的存活及炎性介质的释放[8]。RAGE是HMGB1作用的受体，胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)可能是参与HMGB1调节的下游蛋白信号[9]。本研究拟通过制备LMP-1重组质粒，并滴鼻观察其对变应性鼻炎鼠模型鼻黏膜组织RAGE，HMGB1及TSLP等免疫调节信号表达的影响，进一步探讨病毒感染对变应性鼻炎及哮喘发作的免疫学调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用BALB/c小鼠饲养于吉林大学白求恩医学部实验动物中心，雌雄各20只，均为8到10周龄，体重在20至25 g，12 h间断照明饲养。造模致敏用卵清蛋白(OVA)和氢氧化铝胶为美国Sigma公司产品。

LMP-1插入片段大小为1 161 bp，Gene ID:378750。LMP-1重组质粒及脂质体由中国公共蛋白及质粒实验室(PPL)制备。鼠源性的RAGE，HMGB1及TSLP为RD公司产品。二抗及免疫印迹试剂盒为公司产品。

1.2 分组、致敏及给药

将40只BALB/c鼠分为两组，即AR模型组及质粒组，每组 20只鼠。两组动物在第0、7、14天先给予20 μg OVA及氢氧化铝腹腔注射。然后每侧鼻腔给予5% OVA10 μl滴鼻激发，连续5天。之后，AR模型组动物连续两天给予20 μl空白脂质体滴鼻，质粒组连续两天给予20 μl脂质体包裹的质粒(质粒和脂质体比例1∶2.5，浓度为0.25/μl)[10]。

1.3 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测

取材获得AR组及质粒组动物的鼻黏膜组织，进行WB检测。组织经过裂解液RIPA裂解，变性。然后将两组获得的组织样品进行SDS-PAGE电泳，然后将电泳结果转到PVDF膜。转膜后进行封闭，分别加入鼠源性的RAGE，HMGB1及TSLP的IgG一抗(1∶200)孵育60 min。加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗，具体操作参照试剂盒进行。使用BeyoECL Plus(P0018)显影成像。内参照物为β-Actin。

1.4 统计学方法

实验所得数据采用均数±标准差表示。所得数据进行正态性检验，统计学采用SPSS19.0软件进行分析。组间数据比较采用t检验。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

两组动物经OVA滴鼻激发后均产生喷鼻、抓鼻等鼻变态反应的表现。Western blot结果显示，与AR模型组比较，LMP-1重组质粒组小鼠鼻黏膜组织HMGB1、RAGE及TSLP高表达，质粒组显著高于AR模型组表达水平，结果具有统计学意义(P≤0.05),结果见表1。

表1 2组小鼠鼻黏膜组织HMGB1，RAGE以及TSLP表达

3 讨论

HMGB1 是一种在哺乳动物组织细胞核内丰富表达的非组蛋白染色体结合蛋白,也是一种重要的炎性介质启动信号，相关研究证实其在鼻咽癌细胞高表达[11]。Leonardo Cavone 最新研究发现变应性鼻炎患者鼻腔分泌物中HMGB1表达水平增加，HMGB1 能够促进嗜酸性粒细胞的存活及炎性介质的释放，从而促进了鼻变态反应的发生和放大，是调节鼻黏膜 Th2 反应的重要信号。此外，NARES 及鼻息肉患者鼻腔分泌物中HMGB1水平也高于健康对照。甘草酸(GLT)通过与 HMGB1 结合可降低鼻变态反应的强度。同时，布地奈德喷鼻也可降低鼻炎患者的鼻腔分泌物中 HMGB1 的水平。GLT 和布地奈德对 HMGB1抑制后，鼻黏膜嗜酸性粒细胞活性被抑制，炎性介质的释放明显降低，鼻腔症状也被控制[12]。

对鼻变态反应强度的正向调节因素较少。本研究结果显示，LMP-1重组质粒组小鼠鼻黏膜组织RAGE，HMGB1与AR模型组比较高表达，证实EB 病毒主要特征基因潜伏膜蛋白 1可能是正向调节Th2方向鼻变态反应的重要因素之一。此外，TSLP的Western blot结果显示其在质粒组鼠模型鼻黏膜组织高表达，与AR模型组对照比较结果具有统计学意义(P≤0.05)。之前的研究证实，变应性鼻炎患者鼻黏膜上皮细胞中 TSLP 高表达，并且与症状评分以及嗜酸性粒细胞计数相关，TSLP在过敏性鼻炎鼻黏膜组织高表达与鼻变态反应的强度正向相关，可能是放大、调节变应性鼻炎强度的关键信号[13]。本研究结果证实HMGB1的表达水平与TSLP表达也具有一定的相关性，在调节过程中也存在潜在的相互联系。老年人的变应性鼻炎(AR)由于老年人免疫应答能力下降,老年AR病人的免疫学表现及临床干预手段应该特殊考虑[14]。对于那些合并哮喘，心脏病及病毒感染的群体应予以综合分析[15]。然而,目前对于老年AR尚缺乏足够的研究。本研究关注老年变应性鼻炎群体可能存在的病毒感染因素进行相关分子生物的检测，希望对有关老年人的变应性鼻炎诊断和治疗的推荐意见提供一些帮助。

以往的研究多集中在鼻病毒对哮喘等下气道变态反应的影响,而缺少 病毒相关蛋白对变应性鼻炎鼻黏膜上皮的系统研究。EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)是 EB 病毒的重要特征性基因。研究中通过构建质粒，包裹脂质体，滴鼻变应性鼻炎动物模型鼻黏膜组织，进而观察该基因对表达相关蛋白的情况。研究通过设立对照组，采用Western的方法检测变应性鼻炎患者鼻黏膜 HMGB1 表达水平。最新研究表明变应性鼻炎患者鼻腔黏膜及分泌物中 HMGB1表达水平增加是鼻变态反应中的关键信号。本研究检测鼻黏膜上皮细胞胞内 HMGB1 水平的变化。并与对照组进行比较分析。证实 EB 病毒的特征性基因 LMP1 及其蛋白产物刺激鼻黏膜上皮细胞产生 HMGB1，鼻黏膜上皮细胞也是 HMGB1 的重要来源之一，参与了鼻变态反应的发生及放大作用。Receptor for advanced glycation end-products(RAGE)是 HMGB1的作用受体，TSLP是 HMGB1的下游蛋白。研究中也检测鼻腔黏膜组织标本中 RAGE 的表达情况。证实转染LMP1 质粒能够上调RAGE的表达水平。证实其可能是参与该细胞信号通路的调节靶点蛋白之一。

总之，EB 病毒主要特征基因潜伏膜蛋白 1诱发鼻变态反应可能与病毒诱导的 HMGB1有关，EB 病毒 LMP1 蛋白可能诱导鼻黏膜上皮细胞及其他免疫相关细胞释放大量的 HMGB1，后者进一步激活并诱导上皮细胞内 TSLP等信号的强化，促进嗜酸性粒细胞的存活及炎症介质的释放，从而加重鼻变态反应。鼻黏膜上皮细胞可能是启动鼻变态反应的关键靶细胞，本研究主要是初步证实鼻黏膜上皮细胞 EB 病毒关键蛋白对鼻变态反应的诱导、增强作用，进一步研究 LMP-1 刺激释放的 HMGB1 在鼻变态反应调节的机制是未来重要的研究方向。