Masson染色联合图像半定量分析对肾间质纤维化的诊断及评价研究

王文涛，李燕，黄婷，张亚莉

我国成年人患慢性肾脏病（CKD）的比例为10.8%，预计我国现有的成年人CKD患者达1.2亿[1]。肾间质纤维化（RIF）是CKD发展至终末期肾病（ESRD）的主要病理基础[1]，也是反映肾功能下降严重程度、判断预后的重要指标之一[2]。而目前临床缺乏诊断RIF简单易行的可靠指标。本研究旨在探讨Masson染色联合图像半定量分析对RIF的诊断价值，找到客观易行的评价RIF的指标，以尽早进行预防和抑制这一变化过程，对延缓CKD病情进展具有十分重要的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2016年1—9月于西安交通大学第一附属医院肾内科行肾活检、排除继发性肾脏疾病、诊断为慢性间质性肾炎（CIN）及慢性肾小球疾病（CGD）患者149例作为RIF组，其可分为CIN亚组（包括病理诊断为小管间质性炎，伴或不伴系膜增生性肾小球肾炎患者，n=26）、CGD亚组（n=123）。根据CGD常见类型，分为IgA肾病（IgAN，包括伴有肾小球硬化的IgAN患者，n=79）、慢性肾小球肾炎（n=44）；根据LEE氏标准[3]将IgAN分为IgAN Ⅱ级（n=3）、IgAN Ⅲ级（n=35）、IgAN Ⅳ级（n=25）、IgAN Ⅴ级（n=16），根据慢性肾小球肾炎硬化程度分为局灶硬化性肾小球肾炎（FSGN，n=31）、增生硬化性肾小球肾炎（PSGN，n=10）、硬化性肾小球肾炎（SGN，n=3）。将同期于本院行肾脏穿刺活检明确无RIF的Ⅰ～Ⅱ期膜性肾病患者27例作为对照组。

1.2 生化检查 全自动生化检测仪测定研究对象在入院期间的血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、胱抑素C。全自动流式血细胞计数仪测定研究对象在入院期间的血红蛋白（Hb）。放射免疫法测定研究对象在入院期间的血及尿β2微球蛋白（β2-MG）。

1.3 图像软件处理 将西安交通大学第一附属医院病理科制好的Masson染色的肾脏病理切片，使用Nikon801 正置荧光显微镜 Plan Fulor 40X/0.75 物镜、目镜 10X/22（×400）采集图像，输入 Image-Pro Plus 6.0图像分析仪测量系统，选择HSI模式（将吸管颜色设定为黄色），设置H、S、I参数，当H在“117～200”、S在“0～255”、I在“180～240”时基本可以选中图片中所有的胶原纤维。测量阳性区域总积分光密度，每张病理切片取5个视野（上、下、左、右及中央）定量检测Masson染色的肾脏病理切片的积分光密度，总积分光密度与测量区域总面积相除，计算出平均光密度（MOD）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件统计进行数据分析。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析。以病理结果为金标准，构建MOD诊断RIF的受试者工作特征曲线（ROC曲线），计算最佳截断值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RIF组与对照组

2.1.1 基本资料 RIF组和对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

2.1.2 RIF组与对照组的临床指标 RIF组BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；RIF组和对照组Hb比较，差异无统计学意义（P=0.173，见表2）。

本文创新点：

本研究通过测量肾间质的平均光密度（MOD）来间接反映肾脏间质纤维化程度，减少病理科医师主观影响，希望能为肾脏间质纤维化患者的诊断提供新的依据。

本文不足：

（1）本课题仅检测了Masson染色的病理组织切片中肾间质的MOD，未对其他染色方法的MOD做相关研究；（2）本文病例数较少，如有条件，可通过大样本量的病例研究以减小误差影响；（3）如有条件，可通过动物实验并同步进行与纤维化相关的因子检测并进行比较，以助于进一步确定诊断界值。

表1 RIF组和对照组基本资料比较Table 1 General characteristics of RIF group and control group

表2 RIF组和对照组临床指标比较Table 2 Clinic indicators of RIF group and control group

2.1.3 RIF组MOD与临床指标的相关性 RIF组MOD为 0.017 9（0.015 2，0.023 3）。RIF 组的 MOD 与 Scr、血及尿β2-MG呈正相关，与Hb呈负相关（P＜0.05）；RIF组的MOD与BUN、胱抑素C无相关关系（P＞0.05，见表3）。

表3 RIF组MOD与临床指标相关性Table 3 Correlations of MOD and clinic indicators in RIF group

2.1.4 RIF组与对照组MOD比较 对照组MOD为0.005 6（0.004 1，0.007 3）。RIF组的MOD高于对照组，差异有统计学意义（Z=-7.954，P=0.001）。

2.1.5 MOD诊断RIF的价值 MOD诊断RIF的ROC曲线下面积为0.982〔95% CI（0.961，1.000）〕，最佳截断值为0.012 3，灵敏度为0.886，特异度为0.963，见图1。

图1 MOD诊断RIF的ROC曲线Figure 1 The AUC of MOD in the diagnosis of RIF

2.2 CIN亚组、CGD亚组、对照组比较

2.2.1 基本资料 三组性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。三组年龄比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CIN亚组年龄高于CGD亚组、对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CGD亚组和对照组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表4）。

表4 CIN亚组、CGD亚组、对照组基本资料比较Table 4 General characteristics of CIN and CGD subgroups and control group

2.2.2 临床指标 三组BUN、Scr、胱抑素C、Hb、血及尿β2-MG比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CIN亚组BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CIN亚组Hb低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。CGD亚组BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。CIN亚组BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于CGD亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CIN亚组Hb低于CGD亚组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表5）。

2.2.3 MOD CIN 亚组 MOD 为 0.019 1（0.015 6，0.025 2），CGD 亚组 MOD 为 0.017 6（0.015 1，0.023 3）。三组的MOD比较，差异有统计学意义（Z=64.536，P＜0.05）。CIN亚组MOD高于对照组，差异有统计学意义（Z=-6.138，P＜0.05）。CGD亚组MOD高于对照组，差异有统计学意义（Z=-7.790，P＜0.05）。CIN亚组和CGD亚组MOD比较，差异无统计学意义（Z=-1.298，P＞0.05）。

表5 CIN组、CGD组、对照组临床指标比较Table 5 Clinic indicators of CIN and CGD subgroups and control group

2.2.4 MOD诊断CIN亚组、CGD亚组RIF的价值 以病理结果为金标准，MOD诊断CIN亚组RIF的ROC曲线下面积为0.991〔95% CI（0.975，1.000）〕，最佳截断值为0.011 8，灵敏度为1.000，特异度为0.926，见图2。

MOD诊断CGD亚组RIF的ROC曲线下面积为0.980〔95% CI（0.958，1.000）〕，最佳截断值为0.008 0，灵敏度为0.992，特异度为0.852，见图2。

图2 MOD诊断CIN亚组、CGD亚组RIF的ROC曲线Figure 2 The ROC curves of MOD in the diagnosis of RIF in CIN and CGD subgroups

2.2.5 三组MOD与临床指标的相关性 CIN亚组和对照组的MOD与临床指标无相关关系（P＞0.05）。

CGD亚组MOD与胱抑素 C、血及尿β2-MG呈正相关，与Hb呈负相关（P＜0.05）；CGD亚组MOD与BUN、Scr无相关关系（P＞0.05，见表6）。

2.3 对照组与不同IgAN分级患者MOD比较 IgAN患者 MOD 为 0.007 7～0.036 5，对照组 MOD 为 0.003 0～0.014 9。对照组、不同IgAN分级患者MOD比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。IgAN Ⅱ、IgAN Ⅲ、IgAN Ⅳ、IgAN Ⅴ级患者MOD均高于对照组，差异有统计学意义（Z=-2.800、-6.126、-5.925、-5.402，P值均＜0.001）；且IgAN Ⅳ、IgAN Ⅴ级患者MOD均高于IgAN Ⅲ级，差异有统计学意义（Z=-2.122、-2.395，P=0.034、0.017，见表7）。

2.4 对照组与不同慢性肾小球肾炎硬化程度患者MOD比较 慢性肾小球肾炎患者 MOD 为 0.009 1～0.035 8。对照组与不同慢性肾小球肾炎硬化程度患者MOD比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中FSGN、PSGN、SGN患者的MOD高于对照组，差异有统计学意义（Z=-6.337、-4.617、-2.800，P值均＜0.001）；PSGN的MOD高于FSGN，差异有统计学意义（Z=-2.398，P＜0.05，见表 8）。

表6 CIN亚组、CGD亚组、对照组的MOD与临床指标的相关性Table 6 Correlations of MOD with clinic indicators in CIN and CGD subgroups and control group

表8 不同慢性肾小球肾炎硬化程度患者与对照组的MOD比较〔M（P25，P75）〕Table 8 Comparison of MOD between patients with different degree of chronic glomerulonephritis and control group

3 讨论

3.1 RIF概述 RIF是肾脏疾病发展至ESRD的主要病理基础，RIF程度越重，提示肾功能损害越严重，预后越差。近年来诸多研究表明，无论是原发性肾小球疾病还是继发性肾小球疾病，小管间质病变的严重性与肾小球病变的活动性、肾脏组织学活动指标、肾功能受损程度均呈正相关[4-6]。肾小管间质内单核细胞、巨噬细胞浸润的程度与肾功能损伤程度密切相关，并且肾功能减退的程度与小管间质纤维化有密切的关系。因此，早期诊断，尽早进行干预，对于改善CKD患者生活质量意义重大。目前关于RIF评估的临床指标有限，临床常用的BUN、Scr等血清学指标可反映肾功能，而尿β2-MG主要反映近端肾小管重吸收功能，尿液浓缩-稀释试验主要反映远端肾小管及集合管的功能，均无法反映RIF的程度。有报道超声、核磁共振等[7-9]检查可评价RIF，病理切片的积分光密度[10-13]间接反映RIF，且需要检测各种因子的表达，目前公认肾脏中的结缔组织生长因子、单核细胞趋化因子蛋白1及转化生长因子β1[10]是RIF发生发展的重要细胞因子，其表达越高提示RIF的程度可能越高，但因检测要求技术高，费用高昂，目前主要应用于动物实验中，也有报道可以通过检测血或尿中的单核细胞趋化因子蛋白1、转化生长因子β1、结缔组织生长因子表达来反映RIF程度[14-16]。目前病理检查为诊断RIF的金标准，其中Masson对胶原纤维的特殊染色，依靠病理医师在显微镜下观察来评定RIF程度，受医师水平的影响，存在着主观性且无法量化的指标评价纤维化程度，目前的计算机辅助病理诊断在临床诊断方面逐渐得到应用，但其主要通过检测免疫组化病理切片的阳性面积或积分光密度来间接反映RIF，需要进行特殊染色以检测各种因子，临床操作复杂，费用高。本研究通过Masson染色联合图像处理软件，计算不同肾组织间质的MOD，以量化指标对RIF进行评价。

3.2 MOD与RIF 本研究结果显示，CIN亚组、CGD亚组的MOD均高于对照组，提示该方法可以反映肾脏的纤维化病变，原因可能为：在慢性肾小球肾炎的病理改变中，早期以肾小球病变为主，随着疾病的进展，肾脏间质及小管也会发生改变。而在CIN中，肾间质及小管的损害也可以通过增加肾小球后的阻力、降低肾小球滤过率，继而引起肾小球硬化。

本研究结果显示，MOD预测RIF的最佳截断值为0.012 3，灵敏度为88.6%，特异度为96.3%；CIN亚组及CGD亚组的最佳截断值分别是0.011 8、0.008 0，灵敏度分别是100.0%、99.2%，特异度分别是92.6%、85.2%，提示MOD可以间接反映RIF程度，且均有较高的特异度及灵敏度。建议对CIN及CGD可以取不同的界值。

目前我国主要按照LEE氏标准对IgAN进行分级[3]：IgANⅠ级，在绝大多数是正常的肾小球中，偶尔可见轻度系膜增宽伴或不伴细胞增生，肾间质及小管无病变。IgANⅡ级，肾小球局灶性系膜增生和硬化程度小于50%，小新月体罕见，肾间质及小管无病变。IgAN Ⅲ级，系膜弥漫增生、增宽（偶尔为局灶节段），小新月体少见，可出现局灶间质水肿，细胞浸润少见，肾小管萎缩罕见。IgAN Ⅳ级，肾小球重度弥漫增生和硬化，肾小球可呈部分或全部硬化，新月体≤45%，肾小管萎缩，肾间质炎性细胞浸润，间质泡沫细胞少见。IgAN Ⅴ级，病变比Ⅳ级更重，肾小球新月体＞45%，肾小管和间质病变比Ⅳ级重，原因可能为IgAN硬化程度越重，RIF程度越重有关。本研究结果显示，慢性肾小球肾炎不同硬化程度患者的MOD不同。FSGN的肾小球呈局灶节段性分布，病变肾小球系膜基质增多，呈无细胞性硬化，肾间质及小管病变常伴发；PSGN的肾小球硬化程度在50%左右，伴有其他肾小球的增生性病变及肾间质和小管的严重病变；SGN的肾小球硬化超过75%以上，伴有肾间质和小管的严重病变[17]，原因可能为硬化程度越重，RIF程度越重。

3.3 RIF与临床指标的关系 本研究结果显示，RIF组的MOD水平与Scr、血及尿β2-MG呈正相关，与Hb呈负相关，提示有RIF的患者，其RIF程度越重肾功能损害也越重，原因可能为CIN随病变进展也会累及肾小球。本研究结果显示，CGD亚组的MOD与Hb呈负相关，与胱抑素 C、血及尿β2-MG呈正相关，提示慢性肾小球肾炎组的RIF程度越重，肾功能损害也越重，原因可能为临床上CGD早期是以肾小球病变为主，但随着病变进展会合并间质及小管病变。

综上，通过Image-Pro Plus 6.0软件采集肾脏病理间质图像，计算出MOD是一种简单、易操作，可重复性的检测方法，并可以以量化的指标反映RIF程度，为临床治疗提供依据及帮助，以改善患者生活质量，延长生命。但因为本研究为回顾性研究，且关于界值、灵敏度及特异度也没有参考，临床诊断与病理类型对RIF的关系也未进行相关研究，因此还需大量的基础研究及临床研究来进一步探索。

本文无利益冲突。