CK-20和LGALS4在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

王志杰 栗晓东 田亮 张强 董路玲 宁建峰 霍占江

作者单位：075000 张家口 张家口市第一医院1耳鼻咽喉头颈外科，2内分泌科，3检验科

甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌是其常见的病理类型，约占甲状腺癌的80%～85%［1］。甲状腺乳头状癌预后良好，病死率低，但易发生颈部淋巴结转移，具有较高的局部复发和癌症特异性死亡风险［2-3］。因此，早期识别和监测甲状腺乳头状癌有重要意义。细胞角蛋白-20（cytokeratin-20，CK-20）是上皮细胞和上皮源性恶性肿瘤细胞的重要成分。研究报道CK-20高表达于膀胱癌和结肠癌肿瘤组织及血液中，并与肿瘤发生发展密切相关［4-5］。半乳糖凝集素4（galectin-4，LGALS4）是半乳糖凝集素家族的重要成员，在结直肠癌、胰腺癌等细胞中高表达，广泛参与细胞凋亡、增殖及肿瘤转移等多种生理病理过程［6-7］。此外，网站（http：//www.coexpedia.org/index.php）核酸分析显示，LGALS4与CK-20在非小细胞肺癌、食管癌、胰腺癌等多种肿瘤中共表达，参与肿瘤细胞增殖、侵袭及炎症反应过程［8］。但是 CK-20、LGALS4在甲状腺乳头状癌发生发展中的作用尚不明确。本研究检测甲状腺乳头状癌组织中CK-20、LGALS4表达，并分析其诊断及预后评估的价值，以期为甲状腺乳头状癌的临床治疗及预后评估提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月—2014年6月于张家口市第一医院接受手术且经组织病理证实的128例甲状腺乳头状癌患者为研究对象，收集术后癌组织及相应癌旁正常组织石蜡包埋标本。纳入标准：⑴符合甲状腺乳头状癌诊断标准［9］；⑵术前无手术史及放化疗等抗肿瘤治疗；⑶无内分泌相关疾病病史及严重心脑血管疾病；⑷临床资料完整。排除标准：⑴合并其他恶性肿瘤患者；⑵合并全身免疫性疾病、肝脏疾病及肾脏疾病患者；⑶碘剂治疗后6～12个月获得血清甲状腺球蛋白和甲状腺球蛋白自身抗体者；⑷妊娠期女性。所有患者均为高分化癌；其中男性34例；平均年龄（45.4±4.2）岁（范围：20～70岁）；有远处转移 18例；有淋巴结转移30例；TNM分期［10］：Ⅰ期53例，Ⅱ期42例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例。本研究经张家口市第一医院道德伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2 方法

所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，连续4 μm厚切片，采用免疫组化En Vision两步法检测甲状腺乳头状癌组织及癌旁正常组织中CK-20、LGALS4的表达，以PBS代替一抗作为空白对照，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。兔抗人LGALS4多克隆抗体购自美国Abnova公司，兔抗人CK-20单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物制剂有限公司。

免疫组化染色结果由3名病理科的专业人员进行独立阅片。CK-20、LGALS4主要定位于细胞质或细胞膜，均以出现棕黄色颗粒为阳性表达。采用Remmele半定量法［11］对阳性结果进行评分，阳性细胞表达百分比评分：0分（＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）；着色强度评分：0分（无着色或着色不清），1分（浅黄色），2分（棕黄色），3分（深褐色）；染色指数（SI）为阳性细胞表达百分比评分与着色强度评分乘积，以SI＜2为阴性表达，SI≥2为阳性表达。

1.3 随访

患者治疗后通过门诊复查方式随访，记录患者无病生存期（disease-free survival，DFS）。DFS 定义为术后至首次出现复发转移或由疾病进展导致死亡的时间。随访前3年每6个月随访1次，之后每年随访1次，随访截至2019年11月30日，中位随访时间为27个月。随访期间，29例（22.66%）复发转移；19例（14.84%）死亡；其中9例死于甲状腺乳头状癌，10例死于心血管疾病或意外等其他原因；无失访病例。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。分类资料采用n（%）表示，组间比较采用χ2检验；Spearman等级相关分析甲状腺乳头状癌组织中CK-20表达水平与LGALS4表达水平相关性；受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析 CK-20、LGASL4对甲状腺乳头状癌的诊断价值；采用Kaplan-Meier法计算生存率，组间生存曲线比较采用Log-rank检验；多因素Cox回归分析影响患者DFS的因素。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CK-20、LGALS4在甲状腺乳头状癌组织中的表达情况

免疫组化结果显示，甲状腺乳头状癌组织中CK-20阳性表达率高于癌旁正常组织（85.9% vs 25.0%，χ2=96.213，P＜0.001），见图 1；LGALS4 阳性表达率低于癌旁正常组织（32.8% vs 89.8%，χ2=87.771，P＜0.001），见图2。

图1 CK-20在甲状腺乳头状癌组织及癌旁正常组织中的表达（×400）Fig.1 The expression of CK-20 in papillary thyroid carcinoma tissues and adjacent normal tissues（×400）

图2 LGALS4在甲状腺乳头状癌组织及癌旁正常组织中的表达（×400）Fig.2 Expression of LGALS4 in papillary thyroid carcinoma tissues and adjacent normal tissues（×400）

2.2 CK-20、LGALS4表达与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征的关系

甲状腺乳头状癌组织中CK-20、LGALS4表达水平均与肿瘤远处转移、TNM分期、淋巴结转移有关（均P＜0.05），未发现其与患者性别、年龄有关（均P＞0.05），见表1。Spearman相关分析显示，CK-20与LGALS4表达水平呈负相关（r=-0.531，P＜0.001）。

2.3 CK-20、LGALS4对甲状腺乳头状癌的诊断价值

ROC曲线分析结果显示，CK-20、LGALS4及两者联合诊断甲状腺乳头状癌的曲线下面积分别为0.840（95% CI：0.788～0.892，P＜0.001）、0.785（95% CI：0.727～0.843，P＜0.001）、0.938（95% CI：0.912～0.964，P＜0.001），敏感度分别为85.9%、67.2%、100.0%，特异度分别82.0%、89.8%、71.9%。CK-20、LGALS4联合诊断甲状腺乳头状癌的曲线下面积优于CK-20、LGALS4（Z=3.270，P=0.001；Z=4.680，P＜0.001）。见图 3。

2.4 甲状腺乳头状癌组织中CK-20、LGALS4表达水平与患者DFS的关系

Kaplan-Meier分析结果显示，甲状腺乳头状癌患者5年DFS为70.3%；CK-20阳性表达患者5年DFS低于CK-20阴性表达患者（66.36% vs 94.44%，Logrank χ2=5.027，P=0.025）；LGALS4 阳性表达患者5年DFS高于LGALS4阴性表达患者（85.71% vs 62.79%，Log-rank χ2=7.644，P=0.006），见图 4。

表1 甲状腺乳头状癌组织中CK-20、LGALS4表达水平与患者临床病理特征的关系［n（%）］Tab.1 Relationship of CK-20 and LGALS4 expression in papillary thyroid carcinoma tissues with clinicopathological features［n（%）］

图3 CK-20、LGALS4诊断甲状腺乳头状癌的ROC曲线Fig.3 ROC curves of CK-20 and LGALS4 in diagnosis of papillary thyroid carcinoma

2.5 影响甲状腺乳头状癌患者DFS的Cox回归分析

单因素Cox回归分析显示，CK-20高表达、远处转移、TNM分期、淋巴结转移及LGALS4高表达与患者DFS有关（均P＜0.05），见表2；多因素Cox回归分析显示，CK-20高表达、远处转移、淋巴结转移是患者DFS的独立危险因素，LGALS4高表达是患者DFS的保护因素（均 P＜0.05），见表 3。

图4 CK-20、LGALS4阳性与阴性表达甲状腺乳头状癌患者的Kaplan-Meier生存曲线Fig.4 Kaplan-Meier survival curves for papillary thyroid carcinoma patients with CK-20，LGALS4 positive and negative expression

表2 影响甲状腺乳头状癌患者DFS的单因素分析Tab.2 Univariable analysis of affecting DFS in papillary thyroid carcinoma patients

表3 影响甲状腺乳头状癌患者DFS的多因素分析Tab.3 Multivariable analysis of affecting DFS in papillary thyroid carcinoma patients

3 讨论

CK-20是一种低分子量细胞角蛋白，具有上皮组织特异性，其表达大多局限于胃肠道上皮、尿路上皮细胞和Merkel细胞中，且在肿瘤组织及血液中表达升高。研究发现，CK-20 mRNA高表达于甲状腺乳头状癌、滤泡型甲状腺癌、未分化型甲状腺癌的肿瘤组织和外周血中，并与肿瘤TNM分期、转移及复发密切相关，可作为判断甲状腺癌分期的标志物［12］。近年来研究发现，肺癌中CK-20阳性表达在不同T分期、淋巴结转移、浸润程度、肿瘤大小和临床分期中均存在明显差异，且CK-20阳性表达对肺癌患者的生存结局有不利影响［13］。本研究发现，甲状腺乳头状癌组织中CK-20阳性表达率高于癌旁正常甲状腺组织，且CK-20高表达与肿瘤远处转移、TNM分期、淋巴结转移有关，提示CK-20可能作为促癌因子参与甲状腺乳头状癌发生发展及转移进程。进一步研究发现，CK-20诊断甲状腺乳头状癌的曲线下面积为0.840，敏感度为85.9%，特异度为82.0%，提示CK-20在甲状腺乳头状癌诊断中具一定价值。此外，本研究中CK-20阳性表达患者5年DFS低于阴性表达患者，且CK-20高表达是DFS的独立危险因素，提示CK-20高表达预示预后不良，在甲状腺乳头状癌发生发展中发挥重要作用。

LGALS4是一种多功能外源性凝集素，可参与免疫调节、血管生成、细胞信号转导等过程，在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等过程中发挥重要作用。MAFTOUH等［14］在胰腺癌细胞研究中发现LGALS4高表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移。曾金华等［15］亦发现LGALS4在巨大肝癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁组织和正常肝组织，且LGALS4低表达与巨大肝癌术后早期复发转移有关。本研究发现，甲状腺乳头状癌组织中LGALS4阳性表达率低于癌旁正常甲状腺组织，且其低表达与肿瘤远处转移、TNM分期、淋巴结转移有关，提示LGALS4可能作为抑癌因子参与甲状腺乳头状癌发生及转移进程。进一步研究发现，LGALS4诊断甲状腺乳头状癌的曲线下面积为0.785，敏感度为67.2%，特异度为89.8%，提示LGALS4在甲状腺乳头状癌中虽具一定诊断价值，但敏感度较低，需考虑与其他指标联合检测以提高诊断价值。此外，本研究中LGALS4阳性表达患者5年DFS高于阴性表达患者，且LGALS4高表达是DFS的保护因素，提示LGALS4高表达预示预后良好。

本研究还发现，甲状腺乳头状癌组织中CK-20与LGALS4表达呈负相关，且多因素分析结果亦发现淋巴结转移是患者DFS的独立危险因素，与武元元等［16］研究结果一致。因此推测两者可能协同参与甲状腺乳头状癌发生及转移进程，结合ROC曲线分析结果证实CK-20、LGALS4联合诊断甲状腺乳头状癌的效能均优于其单项。

综上所述，本研究发现甲状腺乳头状癌组织中CK-20与LGALS4表达呈负相关，CK-20高表达预示预后不良，LGALS4高表达预示预后良好，两者联合检测有助于提高诊断效能，两者有望成为监测甲状腺乳头状癌预后的生物标志物。但本研究样本量较小，CK-20、LGALS4与甲状腺乳头状癌的关系仍有待验证，二者相互作用的机制亦需进一步研究。