紫红曲霉A13、Fen发酵红曲米中莫纳克林K的含量测定

刘润璞，孙晓东，李雨恒，韦睿

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116600)

红曲米是我国传统的发酵食品，外表呈现棕红色，质地脆，断面红色，略有酸味，是利用红曲霉在大米中发酵而成[1]。制作时将大米蒸制熟透，以红曲霉接种，使得真菌能够相互扩散、传播、生长发酵。红曲霉(Monascus)是一种典型的丝状真菌[2，3]，也是我国在酿造微生物方面重要的一个属，迄今已有上百年历史。古籍中对其在食品中的应用及功效早有记载，早在北宋时期，“红曲煮肉”就已在陶古的《清异录》中被提及，李时珍撰写的《本草纲目》中也提及红曲霉能够“健脾燥胃，治赤白痢”[4]。红曲霉是能够产生多种具有聚酮结构次生代谢产物的菌种[5，6]，其中的次级代谢产物——日本远藤章教授从红曲霉中分离出的莫纳克林K，能够有效抑制胆固醇合成，高效且低毒地降低血脂[7]。其市场需求量很大，目前已广泛应用于医药、保健品、食品等相关领域。众多学者对其功能性、安全性、结构及作用机理等进行了广泛且深入的研究，取得了令人瞩目的成果[8]。本研究是利用从丹东家庭自制豆酱中分离得到的紫红曲霉发酵产生红曲米，并从中粗提莫纳克林K，对其含量进行测定。该研究为提高红曲米的品质及药用价值，筛选莫纳克林K生产菌奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

紫红曲霉A13、Fen：均分离自丹东地区家庭自制豆酱。

1.1.2 试剂

磷酸、甲醇、乙醇(均为色谱纯)：天津科密欧化学试剂有限公司；高效液相用乙腈(色谱纯)：德国默克公司；莫纳克林K标准品(纯度≥98%)：上海源叶生物科技有限公司；水(超纯水)。

1.1.3 主要培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，琼脂20 g，葡萄糖15 g，水1000 mL，pH自然，用于红曲霉菌株的纯化；液体种子培养基：葡萄糖60 g，蛋白胨25 g，NaNO32 g，KH2PO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1000 mL，pH 5.5；大米固体培养基：泰国籼米，购于超市。

1.2 仪器与设备

HZQ-Q全温震荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；101-3AB电热恒温鼓风干燥箱 上海坤天实验室仪器有限公司；752N分光光度计 上海精科实业有限公司；LS-100HD压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司；HH-3D恒温水浴锅 上海仪纯实业有限公司；SW-CJ-2D双人净化工作台 上海沪净净化设备有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将低温保存的紫红曲霉菌株A13、Fen转接于PDA平板中，于25 ℃黑暗培养7 d。

1.3.2 液体发酵

将活化的紫红曲霉A13、Fen分别接种于装有种子培养基的三角瓶中，加入少量灭菌的玻璃珠(打碎菌丝)，于28 ℃、180 r/min培养7 d。

1.3.3 固体发酵

使用籼米制作大米固体培养基。选取优质籼米进行浸泡处理，使米粒充分吸水膨胀后打散，沥干水分，分装至500 mL罐头瓶中，每瓶装100 g米及50 g水，调pH至5.0，使用封口膜封紧瓶口，于121 ℃灭菌60 min。在超净台中将液体发酵得到的菌液接种到大米固体培养基中，接种量为20 mL。分别设置3个重复，于28 ℃恒温培养15 d。

发酵结束后，将得到的红曲米散开摊平，置于60 ℃烘干箱中，直至其干燥并碾碎保存。

1.3.4 莫纳克林K含量的测定

准确称取20 mg莫纳克林K标准品，使用甲醇溶解并定容到100 mL，得到200 mg/L标样作为标准储备液。用标准储备液分别配制5，10，20，50，100，150 μg/mL 6份标准液，于4 ℃保存。

准确称取烘干并粉碎的固态发酵产物红曲米0.50 g于25 mL比色管中，用70%乙醇分3次进行萃取，定容至刻度线，萃取温度为50 ℃。

1.3.5 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱温：28 ℃；检测波长：238.0 nm；流动相：乙腈∶0.1%磷酸溶液为65∶35(V/V)；进样量20 μL；流速：1.0 mL/min；所有样品均经过0.45 μm滤膜过滤后方可使用。

莫纳克林K含量计算公式：

式中：M为红曲米中莫纳克林K的含量，mg/g；ρ为通过标准曲线计算的莫纳克林K的浓度，μg/mL；V为加入萃取液的体积，mL；m为样品称取的质量，g。

2 结果与分析

2.1 莫纳克林K标准曲线的绘制

标准溶液依照上述方法进样检测后，以峰面积为纵坐标，莫纳克林K浓度为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程为y=1.3949x+47.917(R2=0.9998)，莫纳克林K在5～150 μg/mL内线性关系良好，结果见图1。

图1 莫纳克林K溶液标准曲线Fig.1 Standard curve of Monacolin K solution

2.2 莫纳克林K含量的测定

通过计算得到紫红曲霉A13和Fen固态发酵产物红曲米中莫纳克林K的含量，结果见表1。

表1 紫红曲霉A13和Fen固态发酵产莫纳克林K含量Table 1 The content of Monacolin K fermented by Monascus purpureus A13 and Fen

由表1可知，两种紫红曲霉发酵物中产生莫纳克林K的平均含量：A13为1.79 mg/g，Fen为8.53 mg/g。实验中，每种菌设置的3个重复均呈现出一定程度的差异，由此推测两株紫红曲霉发酵产莫纳克林K具有相对的稳定性，继代接种后菌株个体存在差异，这直接导致发酵产生莫纳克林K的能力也存在小范围的差异。

3 讨论

红曲霉发酵所得的次级代谢产物莫纳克林K对治疗由高胆固醇引起的高血脂、冠心病等有明显的疗效。研究表明，与人工合成或从其他微生物中提取得到的莫纳克林K相比，红曲霉发酵而成的莫纳克林K具有溶解度更高、毒副作用较小等特点，因此疗效更显著[9]。本实验所使用的紫红曲霉A13、Fen均分离自丹东家庭自制豆酱，在相同固态发酵条件下，紫红曲霉Fen较A13发酵产莫纳克林K的量更高。常聪等利用紫外诱变的方法得到红曲霉QH12，固态发酵产物中莫纳克林K产量为1.68 mg/g[10]；刘颖等从不同的红曲类产品中筛选得到的红曲霉NW3-2产量为3.20 mg/g[11]。Suraiya Sharmin 等以褐海藻作为发酵基质，卢颖以燕麦作为发酵基质，分别得到莫纳克林K产量高达13.98 mg/g和19.81 mg/g[12,13]。利用大米为发酵基质，紫红曲霉Fen发酵得到的次级代谢产物莫纳克林K较上述报道的红曲米中的产量略高，而低于改良或者其他基质中的产量。研究表明，紫红曲霉Fen具有一定的发酵产莫纳克林K的能力，可以在后续的实验中挖掘最优的培养基质，并优化其发酵条件。

本研究为首次从丹东家庭豆酱中分离得到紫红曲霉，从豆酱中分离得到的紫红曲霉在豆酱发酵过程中亦起着重要作用。红曲霉分泌的糖化酶能够与α-淀粉酶共同作用将淀粉彻底降解为葡萄糖，进而为其他代谢提供原料，同时也成为豆酱甜味的重要来源。某些红曲霉也能够分泌酯化酶，催化低级脂肪酸酯的合成以及酯的水解[14]。此外，红曲霉还有一定的抑菌作用[15]。A13和Fen分离自豆酱发酵后期，推测其也为豆酱后期颜色加深起到了一定的作用。

本研究将为筛选功能优良的红曲霉菌种、提高次生代谢产物莫纳克林K产量和品质奠定理论基础。