miR-429对乳腺癌细胞增殖的影响及其作用机制

韩清昕 侯琳 吴琍 陈凤婷 于超 纪涵青

(1 青岛大学附属医院乳腺外科，山东 青岛 266003； 2 青岛大学医学部生物化学与分子生物学教研室)

MicroRNAs是一类由20～25个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA，通过与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)碱基互补配对结合，沉默后续靶基因发挥调控作用[1]。miR-429是miRNA-200家族成员之一，其作为癌基因或者抑癌基因在多种肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用[2]。miR-429在多种组织中均有表达，如在胃癌、结直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌组织中均呈异常表达[3]。低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)是一种多功能内吞细胞信号受体[4]，表达于多种细胞表面。LRP1可通过介导细胞外配体的内吞作用影响肿瘤的发生发展[5]。本研究拟探讨miR-429对乳腺癌细胞增殖的影响及其作用机制，为进一步寻找乳腺癌诊断治疗的标志物奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

293T细胞(中国科学院上海细胞库提供)，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(青岛大学医学部中心实验室提供)。

1.2 仪器与试剂

Tecan Infinite Pro全波长多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)，MTT试剂(美国Sigma公司)，鼠抗人GAPDH抗体(北京全式金生物技术有限公司)，兔抗人LRP1抗体(恩晶生物科技有限公司)，pSI-Check2载体、HB-infusionTM无缝克隆试剂盒(汉恒生物科技有限公司)，大肠杆菌菌株DH5a(美国Invitrogen公司)，LRP1基因野生型3′UTR(LRP1-3UTR-wt)、突变型3′UTR(LRP1-3UTR-mu)片段由汉恒生物科技有限公司合成，质粒DNA抽提试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.3 细胞培养

人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于含体积分数0.10胎牛血清和10 g/L的青链霉素溶液的高糖DMEM培养基中，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱内培养，培养至对数生长期时用于后续细胞转染。

1.4 MTT方法检测细胞的增殖能力

取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以每孔约6 000个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔，共铺5块板，待细胞密度达到40%左右进行转染，每孔按mimics NC 0.6 μL+EL转染试剂0.4 μL的体系加入不同的转染成分，按转染成分不同共分为5组，分别为mimics NC组(A组)、空白对照组(B组)、inhibitors组(C组)、inhibitors NC组(D组)和miR-429 mimics组(E组)。转染后的细胞继续于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养。于转染后的0、24、48、72、96 h分别检测细胞活力。检测前每孔加入稀释好的5 g/L的MTT溶液10 μL，培养箱中培养4 h后弃去培养液，每孔加入100 μL溶解甲瓒颗粒，震荡2 min，采用酶标仪检测各孔490 nm波长处的吸光度值(A)。

1.5 Western blot方法检测细胞LRP1蛋白的相对表达量

将转染后的5组细胞去除残留培养液并用PBS清洗3次，加入RIPA蛋白裂解液，提取总蛋白，以BCA法检测蛋白浓度。按SDS-PAGE凝胶试剂盒说明配置体积分数0.10分离胶以及体积分数0.05的浓缩胶，待电泳分离蛋白以后转移至膜孔径为0.45 μm的PVDF膜上；将剪好的条带置于摇床上于50 g/L脱脂奶粉中封闭2 h，用1∶1 000稀释好的鼠抗人GAPDH抗体、兔抗人LRP1抗体于室温摇床上孵育2.5 h，4 ℃下孵育过夜，TBST洗膜10 min，共3次；二抗室温孵育1 h后，TBST洗膜3次。采用ECL发光液显影，目的蛋白的相对表达量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值计算。

1.6 构建荧光素酶报告基因质粒

以人基因组DNA为模板，应用TargetScan 7.1软件预测miR-429与LRP1基因3′UTR潜在的互补结合位点，预测的结合位点位于第167～174个碱基。构建含有miR-429应答序列的LRP1基因3′UTR片段，然后突变结合位点，构建突变型基因片段，目的基因片段及突变型基因片段两端均添加与线性化载体两端一致的基因序列，以便于拼接反应的进行。交由公司合成目的基因片段及突变型基因片段。按照HB-infusionTM无缝克隆试剂盒配置40 μL的酶切体系：400 mg/L载体2 μL，酶1 μL，10×buffer 4 μL、ddH2O 33 μL；将pSI-Check2载体进行双酶切，并跑胶回收；回收的线性化载体置于20 μL连接反应体系中50 ℃温浴20 min，将合成的基因片段与线性化载体连接。

向在室温解冻的100 μL DH5a感受态细胞悬液中加入6 μL连接产物，摇匀后置于冰上30 min，于42 ℃水浴中热击90 s并迅速置于冰上冷却。加入1 mL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37 ℃摇床220 r/min振荡培养1 h。菌液摇匀离心后，取去除900 μL上清液后的100 μL培养基吸打混匀后涂布于含氨苄西林(Amp)的筛选平板上。平板正面向上至菌液完全吸收后倒置培养皿，37 ℃培养24 h。转化后的菌落在平板上挑菌，37 ℃下250 r/min摇菌14 h后用菌液进行双酶切，将阳性克隆菌液送测序公司测序。野生型报告基因质粒含有正确结合位点的基因序列，突变型报告基因质粒含有经突变过的结合位点基因序列，将构建的野生型以及突变型荧光素酶报告基因质粒分别命名为h-LRP1-3UTR-wt和h-LRP1-3UTR-mu。

1.7 重组载体与miR-429 mimics或NC mimics分别共转染293T细胞

将293T细胞按照转染的成分不同随机分为4组，分别为转染h-LRP1-3UTR-mu与NC mimics组(F组)、h-LRP1-3UTR-mu与miR-429 mimics组(G组)、h-LRP1-3UTR-wt与NC mimics组(H组)、h-LRP1-3UTR-wt与miR-429 mimics组(I组)，每组设3个复孔，待96孔板中的293T细胞密度达到50%～70%时进行转染，使用的是汉恒生物浓度为0.8 g/L的转染试剂。将10 μL DMEM与0.16 μg的h-LRP1-3UTR-wt/h-LRP1-3UTR-mu目的质粒以及5 pmoL的miR-429 mimics/NC mimics充分混匀后室温放置(溶液1)，将10 μL DMEM与0.3 μL的转染试剂轻轻混匀(溶液2)，室温放置5 min后将溶液1与溶液2充分混匀，放置20 min。转染前为细胞换取新鲜培养基，加入转染混合物混匀后于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养。转染6 h后换取新鲜培养基，继续培养48 h后进行荧光素酶活性检测。

1.8 双荧光素酶报告基因活性的检测与分析

转染后的F、G、H、I组细胞继续培养48 h，弃掉旧的培养基，用PBS清洗2次，96孔板每孔加入100 μL蒸馏水稀释的1×PLB，用移液枪吹散细胞，置于摇床上室温缓慢摇15 min以后，吸取细胞裂解液至1.5 mL离心管中，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清液于新的EP管中；在96孔板中每孔加入100 μL荧光素酶检测试剂 Ⅱ (LAR Ⅱ)工作液；每孔加入20 μL细胞裂解液，移液枪吹打混匀2～3次以后测定记录萤火虫荧光素酶活性值，此值为内参值。每样品中再加入Stop & Glo®Reagent 100 μL，移液枪吹打混匀后测定记录海肾荧光素酶活性值，为报告基因发光值。荧光检测仪会根据之前检测到的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性值的比值表示相对荧光素酶活性。应用KEGG信号通路分析预测miR-429调控LRP1的表达调节细胞周期的作用机制。

1.9 统计学方法

2 结 果

2.1 miR-429表达对MDA-MB-231细胞增殖影响

析因设计的方差分析结果显示，分组、时间及分组与时间对MDA-MB-231细胞增殖活力有明显的影响(F=3.94～342.90，P<0.05)。自细胞培养的第2天始各组细胞增殖活力与第0、1天比较差异有显著性(F=40.53～116.33，P<0.05)；在细胞培养的第2～4天，E组细胞的增殖活力明显低于B、C、D组(F=4.53～19.12，P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖活力比较

2.2 miR-429表达对MDA-MB-231细胞LRP1蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，E、A、B、C、D组细胞的LRP1蛋白的相对表达量分别为0.51±0.07、1.11±0.29、2.38±0.77、1.83±0.48、1.93±0.48，E组细胞LRP1蛋白相对表达量明显低于A、B、C、D组，差异具有统计学意义(F=6.26，P<0.05)。

2.3 LRP1与miR-429的结合位点预测

通过TargetScan 7.1软件预测发现，LRP1与miR-429存在结合位点(图2)。

图2 TargetScan 7.1软件预测miR-429与LRP1 3′UTR的结合位点

E、A、B、C、D分别为E、A、B、C、D组

图1 Western blot检测转染后各组MDA-MB-231细胞LRP1蛋白的表达情况

2.4 重组载体构建质粒结果

将双酶切后的h-LRP1-3UTR-wt和h-LRP1-3UTR-mu载体质粒进行琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收的片段交由公司测序。比较图3A(LRP1基因3′UTR野生型部分测序图，阴影部分为与miR-429结合序列)和图3B(LRP1基因 3′UTR突变型部分测序峰图，阴影部分为突变与miR-429结合序列)的测序图，表明两种重组质粒构建成功。

A：h-LRP1-3UTR-wt部分测序图；B：h-LRP1-3UTR-mu部分测序图

2.5 荧光素酶活性分析

荧光素酶活性检测结果显示，I组、H组荧光素酶活性分别为0.50±0.01、1.00±0.02，两组比较差异有显著性(t=39.78，P<0.01)。突变后，G组、F组荧光素酶活性分别为0.99±0.38、1.00±0.01，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。通过KEGG信号通路分析LRP1基因结果显示，细胞膜表面的LRP1蛋白可通过参与调节胞内β淀粉样蛋白(Aβ)低聚体的水平，调控细胞周期。

3 讨 论

细胞膜表面的LRP1蛋白可内吞Aβ，在胞内进一步浓缩聚合为Aβ聚合体[6]，Aβ是由在各种组织中广泛存在的淀粉样前体蛋白(APP)经β和γ-分泌酶水解产生。当miR-429过表达使LRP1蛋白翻译量减少时，Aβ聚合体的合成减少，更多的Aβ以低聚Aβ的形式进入细胞，在线粒体内抑制细胞色素c氧化酶Ⅳ亚型(CxⅣ)以及A-β结合乙醇脱氢酶(ABAD)的作用使线粒体功能紊乱诱导细胞死亡，或在线粒体内直接作用于肽基脯氨酸顺反异构酶D(CypD)，通过线粒体膜通道孔(MPTP)进入细胞基质，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)诱导细胞凋亡。已有研究表明APP与侵袭性乳腺癌密切相关，可能抑制乳腺癌细胞的转移[7]。本课题前期实验结果显示，在MDA-MB-231细胞中上调miR-429表达可降低LRP1蛋白表达水平，乳腺癌细胞的迁移能力降低[8]。这可能是由LRP1表达量降低时Aβ聚合体生成减少，抑制APP水解，APP积聚增多而低聚Aβ生成增多引起。

miR-429与人类多种恶性肿瘤密切相关，在不同的癌组织中发挥抑癌或者促癌作用。miR-429通过靶向调控基因表达在肿瘤中发挥抑癌作用，该结果在对骨肉瘤、宫颈癌、胃癌、口腔鳞癌、食管癌及胶质瘤的研究中得到证实[9-14]。有研究表明，miR-429在肺癌、前列腺癌及子宫内膜癌中通过靶向调控基因表达发挥促癌作用[15-17]。YU等[18]的研究结果表明，miR-429在胰腺癌中可通过调节程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的表达，提高胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。本研究MTT实验结果显示，上调miR-429表达后MDA-MB-231细胞增殖活力明显降低，说明miR-429表达可抑制人乳腺癌细胞的增殖。

LRP1作为一种多功能内吞细胞信号受体，具有内吞和信号活性。在肿瘤中LRP1的表达水平经常被下调，有研究认为低LRP1水平是不良预后因素[19]。已经研究证实LRP1在食管癌中发挥调控作用[20]。SONG等[21]的研究表明，miR-205可通过下调LRP1基因的表达来抑制肿瘤细胞的迁移，人类LRP1的表达部分受特异性miRNA的调控，导致肿瘤细胞迁移减少。本研究Western blot实验结果显示，在MDA-MB-231细胞中上调miR-429的表达水平可致LRP1蛋白表达量下调。双荧光素酶报告基因实验的结果显示，miR-429可显著下调h-LRP1-3UTR-wt的荧光素酶表达，说明两者间存在结合作用，miR-429未能下调h-LRP1-3UTR-mu的荧光素酶的表达，说明了突变成功。miR-429对LRP1存在靶向调控作用，在蛋白质翻译的过程中下调LRP1基因的表达。目前关于miR-429以及LRP1在乳腺癌中的研究较少，本研究通过双荧光素酶报告基因的方法成功构建LRP1-3UTR荧光素酶报告基因载体，并首次验证了miR-429与LRP1的靶向调控关系，并通过KEGG通路分析初步证实了miR-429可能是通过调节LRP1基因的表达调控乳腺癌细胞周期的作用机制。

总之，本研究首次验证miR-429通过对LRP1基因的靶向调控作用来抑制乳腺癌细胞的增殖，其对LRP1基因的靶向调控作用是通过与LRP1基因3′UTR互补结合得以实现的，但miR-429靶向调控LRP1基因发挥抑癌作用的机制还需要进一步研究。