piRNA-514对心肌细胞肥大的调控作用及其机制

刘靖 王凯 钱丽丽 董妍涵

(青岛大学转化医学研究院，山东 青岛 266021)

心肌肥厚是患者心脏在超负荷工作时表现出的一种生理性、代偿性和适应性反应，持续性心肌肥厚可能导致心脏重构和心力衰竭，甚至猝死[1]，然而心肌肥厚潜在的分子机制尚没有完全研究清楚，识别调节心肌肥厚的分子对于预防和治疗心力衰竭具有重要意义。piwi互作RNA(piRNA)是一类长度为26～31个核苷酸(nt)的非编码RNA[2]。此前在对果蝇睾丸和胚胎的研究中发现，大多数的piRNA可以抑制转座子活性从而维持基因组的完整性和稳定性[3-4]，能够在生殖细胞或体细胞等不同组织基因中发挥调节作用[5]，还可以作为癌基因或肿瘤抑制因子在许多肿瘤中发挥作用[6]，如piRNA-39980与神经母细胞瘤(NB)的发生有关，过表达的piRNA-39980可促进肿瘤发生，敲低piRNA-39980则能够降低肿瘤活性[7]。已有研究表明，在心脏中存在着多种类型的piRNA，并且在心脏发育过程中表达丰度也会发生改变，推测piRNA很有可能具有调控心脏发育的功能，对心血管系统疾病如心肌肥厚等或许也有一定的调控作用[8]。前期预实验中发现，在异丙肾上腺素(ISO)诱导的肥大心肌细胞中，有多种piRNA表达量发生异常，其中piRNA-514表达异常程度最高，因此本研究以piRNA-514作为研究对象，旨在探讨piRNA-514对心肌细胞肥大的调控作用及其机制，为临床治疗心肌肥厚提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1～2日龄雌雄不限的C57乳鼠以及8周龄雄性C57小鼠均购买自青岛大任富城畜牧有限公司。DMEM-F12培养基、PBS缓冲液、胎牛血清(美国Gibco公司)，RNA逆转录试剂盒、Trizol Reagent、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、SYBR Fast qPCR mix、DEPC原液(日本TaKaRa公司)，PCR引物(深圳华大基因)，siRNA序列及NC对照序列(上海吉玛生物科技有限公司)，Lipofectamine 3000转染试剂(美国Invitrogen公司)，多聚甲醛、乙醇(北京索莱宝科技有限公司)，盐酸阿霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，Mito-Tracker、Phalloidin(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1获取小鼠组织 乙醚气雾麻醉小鼠后，断颈处死，用手术剪剪开小鼠腹腔，依次取出肾、肝、脾、肺和心脏组织，于-80℃超低温冰箱中保存。

1.2.2原代心肌细胞培养 将乳鼠解剖取出心脏，PBS缓冲液中洗涤至无血污，将心脏切碎并与含有胰酶和胶原酶的消化工作液混合，在37 ℃恒温水浴锅中消化5～6 min，收集每次消化后的上清液，剩余组织加入消化液继续消化，直至组织块被完全消化；将收集到的上清液以800～1 000 r/min离心5 min，留沉淀悬浮于DMEM-F12完全培养基中，再次离心去上清液，剩余沉淀悬浮于DMEM-F12完全培养基中，通过250目过滤网过滤到培养皿中，在37 ℃细胞培养箱中差速贴壁培养1 h，最后接种于细胞培养皿中。

1.2.3细胞转染 当原代心肌细胞生长到融合度60%～70%时可进行转染。将agomir-piR-514加入到100 μL无血清的DMEM-F12培养基中混匀，室温放置3～5 min；将5 μL lipofectamin 3000加入95 μL无血清的DMEM-F12中混匀，室温放置3～5 min；上述二者混合均匀，室温静置20～25 min后加入到细胞培养皿中。agomir-piR-514序列为5′-AAUCAGAUGCACCUCAUCUGGUGA-3′，以化学修饰的寡聚脱氧核苷酸agomir-NC为阴性对照，序列为5′-CAGUACUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.2.4实时定量PCR(qPCR)检测小鼠组织和心肌细胞中piRNA-514、心房肽(ANF)、脑利钠肽(BNP)和β-肌球蛋白重链(β-MHC)的相对表达量采用Trizol试剂提取小鼠组织RNA和原代心肌细胞总RNA，测定RNA浓度及纯度，进行PCR反转录和qPCR实验，模板cDNA使用Takara逆转录试剂盒构建，qPCR体系采用Takara试剂盒构建。qPCR定量结果标准化，piRNA-514相对表达量以U6为对照，ANF、BNP和β-MHC的相对表达量以GAPDH值为对照。引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.2.5测定细胞表面积 将转染或加药处理后的原代心肌细胞加入多聚甲醛固定5 min，PBS缓冲液洗涤，丙酮脱水3 min，洗涤后用Triton X-100室温处理20 min，PBS洗涤，加入Phalloidin-TRITC在37 ℃下避光染色45 min，PBS缓冲液洗涤，最后用含DAPI的封片剂进行染色，在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8，德国)下观察并拍摄细胞荧光照片，用Image J软件测定细胞表面积并做定量分析。

2 结 果

2.1 ISO对小鼠部分组织及心肌细胞piRNA-514表达的调控作用

qPCR检测显示，在小鼠的肾、肝、脾、肺以及心脏中piRNA-514的相对表达量分别为1.00±0.02、1.80±0.02、2.08±0.05、10.12±0.01、19.37±0.01，piRNA-514在心脏中的表达量为最高(F=24.47,P<0.01)；qPCR方法检测结果显示，ISO诱导原代心肌细胞0、8、12和24 h时，piRNA-514相对表达量逐渐降低，分别为1.00±0.01、0.80±0.02、0.65±0.01、0.32±0.05(F=12.26，P<0.01)，ANF相对表达量逐渐升高，分别为1.00±0.01、1.42±0.05、1.98±0.02、2.02±0.05(F=4.49，P<0.01)。

2.2 过表达piRNA-514对心肌细胞肥大抑制作用

qPCR检测显示，对照组、ISO组、转染agomir-piR-514组、agomir-NC组心肌细胞piRNA-514的相对表达量分别为1.00±0.01、1.42±0.02、1.98±0.05、1.32±0.01，BNP的相对表达量分别为1.00±0.01、2.12±0.05、1.28±0.02、1.12±0.01，ANF的相对表达量分别为1.00±0.01、2.42±0.01、1.48±0.01、1.12±0.05，对照组和转染agomir-piR-514组间以上指标比较差异具有显著性(F=7.91～14.25，t=14.84～29.43，P<0.05)；Image J软件计算得出各组细胞表面积分别为100±4、187±4、118±2、102±5，对照组和转染agomir-piR-514组间细胞表面积比较差异具有显著统计学意义(F=36.12，t=8.73，P<0.05)。

2.3 过表达piRNA-514对ISO诱导的心肌细胞肥大的抑制作用

qPCR检测结果显示，对照组、ISO组、agomir-piR-514+ISO组、agomir-NC+ISO组心肌细胞中piRNA-514的相对表达量分别为1.00±0.01、0.62±0.01、0.98±0.02、0.66±0.01，ANF的相对表达量分别为1.00±0.01、2.62±0.04、1.28±0.02、2.75±0.01，β-MHC的相对表达量分别为1.00±0.01、2.49±0.01、1.16±0.01、2.51±0.05，ISO组和agomir-piR-514+ISO组间以上指标比较差异具有显著性(F=10.89～21.57，t=6.94～12.96，P<0.05)；计算得出各组的细胞表面积分别为100±5、192±4、118±2、172±5，ISO组和agomir-piR-514+ISO组间细胞表面积比较差异具有显著性(F=23.82，t=16.41，P<0.05)。激光共聚焦显微镜图像显示，与ISO组相比，agomir-piR-514+ISO组的心肌细胞面积减小，肌节组织也减少。见图1。

A:对照组;B:ISO组;C:agomir-piR-514+ISO;D:agomir-NC+ISO组

3 讨 论

心肌肥厚是健康心脏对增加生物力学应力的外在和内部刺激做出的应激反应[9]，主要特征是心肌细胞体积增大[10-12]。持续性心肌肥厚会导致心力衰竭，甚至猝死[12]，因此针对心肌肥厚的分子机制进行研究以寻找新的治疗靶点具有重要的意义。

ANF是一种由心房分泌的循环肽，能够在心肌肥厚的发生阶段被激活[13-16]；BNP是利钠肽系统的组成部分，常作为代偿性心力衰竭和心肌肥厚患者的预后标志物[17]；心脏中β-MHC的表达变化会改变心肌功能，抑制β-MHC的表达能够预防ISO引起的心肌肥厚[18-19]。因此临床上常采用以上指标作为心肌肥厚标记物，通过检测它们的表达水平来探讨心肌肥厚的发生机制。

piRNA是一类新型的非编码RNA[20]，通常与piwi蛋白相互作用形成RNA-蛋白质复合物[21]，这些复合体通过沉默转座因子在转录和转录后水平上对细胞基因的调控发挥着关键作用[22]。转座因子通过加速基因组序列的易位、外显子的改组和双链断裂的修复来促进进化，从而在生物基因组序列中发挥作用[23-24]。另外反转录转座子在糖尿病、肿瘤和其他疾病中也有重要作用[25]，piRNA的发现改变了我们对转座子等基因转录后调控的认知。

piRNA可以在生殖细胞、脑细胞、中枢神经系统和各种体细胞中表达[26-27]，但是关于其在心血管疾病方面的的研究甚少。研究证明piRNA能够存在于心脏系统中，并且在心脏发育过程中表达量会发生改变，因此推测piRNA在心脏中具有调控作用，或许与心血管疾病如心肌肥厚也存在一定关联。

本研究通过预实验发现，在ISO诱导的肥大心肌细胞中，有多个显著差异表达的piRNA，但只有piRNA-514异常程度最高，并且在小鼠不同组织器官检测发现piRNA-514在心脏中的表达峰度最高，进一步证明了piRNA-514与心肌细胞具有一定的联系，所以筛选出piRNA-514作为此次研究对象。本研究采用ISO诱导原代心肌细胞，实验结果表明随着诱导时间的延长，心肌细胞中piRNA-514表达量降低，ANF表达量升高，证明ISO可抑制piRNA-514的表达上调，并且ISO诱导24 h时心肌细胞肥大效果最佳。

同时本研究将能够升高piRNA-514表达水平的agomir-piR-514转染进原代心肌细胞，检测心肌肥厚标记物ANF和BNP的表达变化以及心肌细胞表面积，结果显示，与对照组相比，转染agomir-piR-514组心肌细胞ANF和BNP的表达量降低，细胞表面积减小，证明piRNA-514能够抑制心肌细胞发生肥大。另外在ISO诱导24 h后的体外心肌细胞肥大模型中，将agomir-piR-514转染进心肌细胞，检测ANF以及β-MHC的相对表达量，观察心肌细胞形态的变化以及测定细胞表面积，结果显示升高piRNA-514表达水平以后，与ISO组相比，agomir-piR-514+ISO组心肌细胞ANF和β-MHC的表达量明显降低，细胞体积和表面积也相应减小，证明了过表达piRNA-514可以抑制ISO诱导的心肌细胞肥大。

本实验证明了piRNA-514具有调控心肌细胞肥大的功能，过表达piRNA-514能够抑制ISO诱导的心肌细胞肥大，但是有关心肌肥厚的分子机制尚未研究清楚。有多种生物因子与心肌肥厚的发生过程紧密相关，例如MITF和Foxo3a是常见的转录因子，某些miRNA可能是它们在心肌肥厚发生途径中的下游因子[28]。另外，还有多种信号通路参与调控心肌肥厚的发生，如常见的Akt和ERK1/2信号通路、MAPK通路以及PI3K介导的信号转导途径等[29]。我们下一步将通过转录组测序实验，寻找piRNA-514的下游靶点，找出piRNA-514与靶向因子共同调控心肌细胞肥大的信号通路，为将来的临床应用提供较好的参考依据。