内质网跨膜蛋白EVA1A对肝细胞癌Huh7细胞生物学行为的影响

杨杰杰 徐倩 杨玉玲 李奕璇 王彬 侯琳 李宁

(1 青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学系，山东 青岛 266071； 2 青岛大学附属医院感染科； 3 青岛大学电子信息学院)

肝细胞癌(HCC)是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤[1-2]。现阶段肝癌的临床首选治疗方法仍然是早期手术切除，但术后2年复发率高达55%[3-5]。近年来，大规模临床试验证实靶向治疗可显著延长晚期肝癌患者的生存期，靶向治疗被广泛推荐为一线治疗方法[6-7]，但是靶向治疗的副作用和耐药性又显著降低了其临床效益[8-10]。因此，寻找新的有效分子靶点已成为HCC靶向治疗研究的主要方向。

内质网跨膜蛋白EVA1A基因是于2007年通过高通量筛选鉴定出来的一种参与细胞程序性死亡的新基因[11-12]，定位于人类2号染色体短臂12区(2p12)，在各种脊椎动物中的表达高度保守。研究发现EVA1A过表达可诱导细胞自噬和凋亡[13-15]。值得注意的是，与正常组织相比，EVA1A在食管鳞癌、胃腺癌、胰腺癌等人类肿瘤组织中均有明显的下调或不表达[16-17]，提示其可能参与了这些肿瘤的发生或进展。目前已有研究发现EVA1A在人胃癌、神经母细胞瘤等肿瘤中具有重要功能[12,18]，然而其在HCC中的功能尚未见报道。本研究借助Huh7肝癌细胞模型过表达EVA1A，研究其对Huh7细胞增殖、迁移和凋亡的影响，为进一步探讨EVA1A在肝细胞癌发生发展中的作用及寻找新的HCC治疗靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2019年在青岛大学附属医院确诊为HCC行手术治疗的患者20例，所有患者均未接受过放疗或化疗。于手术过程中切取HCC患者癌组织及其癌旁正常组织，所有组织样本均经病理组织学检查确诊为肿瘤组织和正常组织。人正常肝细胞L02与人肝细胞癌细胞系Huh7来自于青岛大学基础医学院生物化学与分子实验室。

1.2 试剂与仪器

RIPA蛋白提取试剂盒、DAB显色试剂盒以及MTT试剂(北京索莱宝生物科技有限公司)，小鼠抗人EVA1A单克隆抗体及小鼠抗人 GAPDH单克隆抗体(英国Abcam公司)，荧光定量PCR试剂盒、RNA反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，EVA1A、GAPDH引物 (上海生工生物工程有限公司)，Trizol RNA提取试剂盒及DAPI试剂(美国Invitrogen公司)。

1.3 研究方法

1.3.1实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测HCC患者癌组织及其癌旁正常组织中EVA1AmRNA表达水平 将HCC患者癌组织和癌旁正常组织碾碎后用Trizol法提取总RNA，测定两组RNA浓度与纯度，反转录合成cDNA，然后进行RT-qPCR。根据试剂盒使用说明配制反应体系。每个样品设3个复孔，比较HCC患者癌组织和配对癌旁正常组织EVA1AmRNA的相对表达丰度。实验重复3次。以2-△△CT表示样本中mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.2免疫组化染色方法测定HCC患者组织中EVA1A蛋白表达 采用自动脱水机对HCC患者癌组织和癌旁正常组织标本进行梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，5 μm厚切片。从20例HCC患者的癌组织和癌旁正常组织样本中随机抽取15例，按照试剂盒说明书进行EVA1A免疫组织化学染色。免疫组织化学染色结果的判断标准：①按切片中阳性细胞数量占总细胞数量的比例进行计分：阴性计0分，阳性细胞比例1%～10%计1分，阳性细胞比例11%～50%计2分，阳性细胞比例51%～75%计3分，阳性细胞比例>75%计4分。②对阳性细胞的染色程度进行计分：不着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。对两项指标计分相乘，对染色结果进行判断：0～2分为阴性(-)，3～5分为弱阳性(+)，6～8分为阳性()，9～12分为强阳性()。

1.3.3Western blot方法检测细胞系中EVA1A的蛋白表达水平 分别培养正常肝细胞L02细胞、肝细胞癌Huh7细胞，待细胞融合度达90%时，弃掉培养基，用PBS洗涤1次，采用RIPA裂解法提取总蛋白；BCA法测定同时调整蛋白的浓度，加入5×Loading buffer以后加热5 min使蛋白变性。然后SDS-PAGE电泳、转模，封闭2 h，以1∶1 000稀释的鼠抗人EVA1A一抗4 ℃孵育过夜。以GAPDH作为内参照蛋白，TBST洗膜以后，用对应的二抗室温孵育1 h后，重复TBST洗膜步骤，ECL发光显影，使用 ImageG-Pro Plus 6软件分析目的蛋白条带EVA1A和内参蛋白条带GAPDH的灰度值，将目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带的灰度值进行比较,得出目的蛋白的相对表达量，结果以3次重复实验的均值表示。

1.3.4细胞转染并检测EVA1A过表达水平 将肝癌细胞系Huh7分成2组分别进行转染，对照组转染Myc-tag质粒，实验组转染EVA1A-Myc质粒，参照Lipofectamine 2000说明书正常转染24 h后，采用RIPA裂解法分别裂解两组细胞，提取蛋白，并按照1.3.3中Western blot方法进行EVA1A蛋白表达的检测，然后进行条带的灰度值分析，以相对内参GAPDH的灰度值代表EVA1A蛋白的相对表达水平，结果以3次重复实验的均值表示。

1.3.5MTT法检测Huh7细胞的增殖能力 取转染成功后的实验组和对照组Huh7细胞，消化后接种于96孔板，每组设5个复孔，每孔约4 000个细胞，共铺4个板，从培养12 h开始计时，每24 h任取一板采用MTT法测细胞活力，共检测4 d。每个板在距检测前4 h，每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT试剂，4 h以后弃去培养基，每孔再加入DMS0 150 μL，震荡5 min使甲瓒颗粒完全溶解，然后用酶标仪检测波长490 nm处各孔的吸光度值，分别制作实验组和对照组细胞的生长曲线。

1.3.6细胞划痕法检测Huh7细胞迁移能力 取转染成功后的实验组和对照组Huh7细胞，消化后接种于6孔板，待细胞融合度达到90%时进行划痕实验，分别于划痕第0、48小时时观察细胞迁移情况并拍照，应用ImageG-Pro Plus 6软件计算划痕面积，结果取3次重复实验的均值。

1.3.7DAPI染色法检测Huh7细胞的凋亡情况取转染成功后的实验组和对照组Huh7细胞，弃去培养基，使用PBS洗涤1次，加入适量的甲醇固定5 min。弃去固定液后用PBS洗涤1次，加入少量4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，于室温放置5 min，吸去染色液，用PBS洗涤3次，每次3 min。荧光显微镜下观察并拍照。

2 结 果

2.1 HCC患者癌组织、癌旁正常组织中EVA1A mRNA和蛋白表达

RT-qPCR检测结果显示，HCC患者癌组织和癌旁正常组织中EVA1AmRNA平均相对表达量分别为1.099±0.028、0.254±0.034，两者比较差异具有显著性(t=33.23，P<0.01)。免疫组化染色结果显示，HCC患者癌旁正常组织EVA1A表达为阳性，肝细胞呈棕黄色(图1A)；其癌组织EVA1A表达为阴性，细胞不着色 (图1B)。15对标本中，HCC患者癌组织中EVA1A表达阴性14例，癌旁正常组织EVA1A的表达弱阳性及以上13例，两组组织中EVA1A的表达比较差异具有显著意义(χ2=19.29，P<0.001)。

A：癌旁正常组织中EVA1A表达为阳性，细胞呈棕褐色；B：癌组织EVA1A表达为阴性，细胞不着色

2.2 Western blot方法检测L02以及Huh7细胞中EVA1A蛋白的表达水平

L02、Huh7细胞中EVA1A蛋白的表达水平分别为1.041±0.085、0.102±0.031，两者比较差异具有显著性(t=17.98，P<0.01)。

2.3 Huh7细胞转染EVA1A-Myc后EVA1A 蛋白的表达水平

Huh7细胞对照组和实验组中EVA1A蛋白的表达水平分别为0.154±0.051、1.021±0.109，两者比较差异具有显著性(t=12.47，P<0.01)。

2.4 过表达EVA1A的Huh7细胞增殖能力、迁移能力及细胞凋亡的情况

MTT法检测过表达EVA1A后Huh7细胞增殖能力显示,时间、组别、时间与组别交互作用均对Huh7细胞增殖有显著影响(F时间=369.41，F组别=260.26，F时间*组别=119.73，P<0.001)。单独效应结果显示，与第1天相比，实验组和对照组第2～4天Huh7细胞增殖水平明显提高(F=19.63～388.82，P<0.01)。与对照组第3、4天相比，实验组第3、4天Huh7细胞的增殖水平均明显降低(F=39.74、44.50，P<0.01)。见表2。细胞划痕实验结果显示，实验组和对照组的Huh7细胞划痕愈合率分别为0.108±0.022、0.389±0.065，两组比较差异具有显著性(t=7.09，P<0.05)。见图2。DAPI染色后，荧光显微镜观察过表达EVA1A后Huh7细胞的凋亡情况，结果显示，实验组中染色质固缩、出现颗粒物质以及核解体的现象明显增多，其相对凋亡率为2.104±0.054，对照组为1.017±0.101，两组比较差异有显著性(t=-16.43，P<0.05)。见图3。

图3 过表达EVA1A对Huh7细胞凋亡的影响

图2 过表达EVA1A对Huh7细胞迁移能力的影响

表2 过表达EVA1A对Huh7细胞增殖能力的影响

3 讨 论

近年来肝癌的治疗手段取得了显著进展，但我国肝癌患者的死亡率仍高居癌症相关死亡的第3位，复发和转移是死亡的主要原因[19-21]。研究普遍认为细胞凋亡受阻是肿瘤发生的原因之一，寻找肿瘤发生中的凋亡相关基因并进行靶向治疗，已成为肝癌治疗研究的新方向[22-23]。

EVA1A最早于2007年被鉴定为一种参与细胞凋亡的内质网相关蛋白[11]，主要表达于内分泌组织，尤其是肝脏、胃、食管、肾上腺皮质和垂体，提示其在这些器官中具有重要的功能。此外，EVA1A诱导的自噬和凋亡也在脑缺血损伤后的细胞死亡中起重要作用[24-25]。同时EVA1A介导的自噬在胚胎

神经发生[26]、心脏重塑[27]、急性肝损伤[28]、内皮角膜营养不良[29]和控制乙型肝炎病毒的复制[30]中发挥重要作用，上述研究提示了其功能的多样性和复杂性。最近发现EVA1A在人胃癌BGC823细胞、人骨肉瘤U2OS细胞、人食管鳞癌KYSE150细胞以及神经母细胞瘤细胞中过表达，表现出抑癌作用[12,18]，然而EVA1A在HCC中的表达模式、生物学功能和潜在机制尚不清楚。因此，本研究首先鉴定EVA1A在HCC中的表达情况，再进一步研究其对HCC是否具有抑制作用。首先本研究的RT-qPCR、免疫组化检测结果显示，HCC患者癌组织中EVA1AmRNA和蛋白的表达比癌旁正常组织明显降低，提示其对HCC可能有抑制作用。Western blot检测结果也显示，EVA1A蛋白在人HCC细胞系Huh7中表达水平显著低于正常肝细胞L02，与其在组织水平的表达结果一致。进一步以人HCC细胞系Huh7为细胞模型，通过过表达EVA1A观察细胞的生物学行为，即在肝癌细胞Huh7中过表达EVA1A模拟出正常肝细胞的EVA1A水平，通过MTT实验和细胞划痕实验观察对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响，结果显示EVA1A过表达导致细胞增殖和迁移能力明显下降，说明EVA1A在肝细胞癌中发挥有效的抑癌作用。为了探讨EVA1A调控细胞增殖的分子机制，通过DAPI染色法检测EVA1A过表达对细胞凋亡的影响，结果显示过表达EVA1A使Huh7细胞相对凋亡率明显上升，提示其抑癌的作用可能是通过诱导细胞凋亡来实现的。有研究显示EVA1A在胶质母细胞瘤U87、U251、SHG44细胞系、非小细胞肺癌H1299细胞系和宫颈癌细胞HeLa细胞中均显著抑制肿瘤细胞的增殖[11,18,31]，表现出较强的抗肿瘤活性，主要机制是诱导细胞凋亡，本研究与此结论相一致，提示EVA1A是一种有效的广谱抗癌蛋白。同时本研究首次发现EVA1A过表达使Huh7细胞的迁移能力也有明显下降，而上皮间质转化(EMT)对HCC细胞的迁移和侵袭至关重要[32]，因此推测EMT可能是EVA1A参与调控肿瘤细胞迁移的作用靶点，但还有待进一步研究证实。关于EVA1A的抗肿瘤机制，本研究主要集中在促凋亡过程，但也不能排除EVA1A调控自噬的作用，比如在胃癌和胶质母细胞瘤中，EVA1A调控的自噬对其抑癌作用也有重要影响[18,24]，自噬是否介导EVA1A在肝癌中的功能也有待于进一步研究。

综上所述，本研究结果显示，过表达EVA1A抑制了HCC细胞Huh7的增殖和迁移能力。EVA1A作为一种关键的抑癌蛋白，在正常肝脏中具有较高的表达水平，而在HCC中表达异常下调，可能有助于HCC细胞的生长和存活，是HCC发生发展的潜在机制。未来将对EVA1A的表达与HCC患者的临床进展和预后的相关性进一步分析，阐明HCC发生发展过程中EVA1A表达调控的机制，为进一步揭示HCC可能的发病机制和将来利用EVA1A为靶点研发HCC分子靶向药物提供支持。