肉桂油微乳工艺优化及其体外释放

肖小年，刘悦珍，易孜成，章 辉，刘 璟，王 凡，易醒

（南昌大学a.中德联合研究院；b.中德食品工程中心，江西 南昌 330047）

肉桂（Cinnamomumcassia）属于樟科（Lauraceae）植物，是一种常用的药食两用原料。中国是世界上肉桂产量最大的国家，种植历史已经超过2000年，种植区域主要是广东和广西两省［1-3］。肉桂油能够发挥抗氧化、抗菌、抗癌等多种作用，因此在食品、卫生、制剂、包装、化妆品等领域中被广泛地应用［4］。肉桂醛是肉桂油中的主要功效成分，含量高达90%，近些年来被学者们广泛研究［5］。口服肉桂醛可以刺激胰岛素的释放并且改善胰岛素敏感性，从而发挥降血糖的作用［6-9］。肉桂醛也可以通过刺激AMPK活化，促进脂肪酸氧化，阻止细胞分化和脂肪细胞形成［9-10］。此外，大量的研究也已证实，肉桂油对细菌和真菌都有很强的抑制作用［11-15］。肉桂油（Cinnamon Oil，CO）溶解度低、挥发性强，在加工、利用和贮存过程中易在空气、光和加热作用下分解［4］，并且肉桂醛很容易在血液中转化为肉桂酸，从而影响肉桂油发挥其药理活性［16］。因此构建一种提高肉桂油水溶性和稳定性的制剂是十分必要的。

微乳是一个由水、油和双亲性物质表面活性剂组成的热力学稳定的各向同性液体［17］。微乳不仅对难溶性及脂溶性的药物具有增溶作用，还能够提高药物的稳定性，因此在中医药中，用微乳作为制剂的应用越来越多［18］。制备肉桂油的O／W型微乳，是一种提高肉桂油的溶解性、稳定性以及保持其功能性的有效的办法。

目前，国内外对肉桂油的研究主要集中在提取、化学成分鉴定以及相关制剂的制备及质量评价［19-23］，对于肉桂油微乳在体外释放方面的研究报道相对较少。在本研究中，我们讨论了表面活性剂和助表面活性剂的比例（Km）以及温度对于O／W型肉桂油微乳（Cinnamon Oil Microemulsion，COME）形成的影响。从离心、冷热循环和长期储藏3个方面考察了肉桂油微乳的稳定性。此外，还对肉桂油微乳在不同pH介质中的释放动力学和机理进行了讨论。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉桂醛对照品≥99.5%，胃蛋白酶（酶活力1∶3000），胰酶，USP grade，阿拉丁试剂有限公司；肉桂油，吉安国光香料厂；甲醇，乙腈，色谱纯，天津市永大化学试剂有限公司；肉豆蔻酸异丙酯（IPM）、EL-40、Span 80、Tween 80、无水乙醇、丙三醇均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

DDS-307型电导率仪，上海精密科学仪器有限公司；WYA-2W型阿贝折射仪，上海精密科学仪器有限公司；PB-10型pH计，赛多利斯科学仪器有限公司；NICOMP380ZL型激光纳米粒度测定仪，美国PSS粒度分析仪公司；JB-3型恒温磁力搅拌器，上海雷磁新泾仪器有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉桂油微乳的制备

把肉桂油和肉豆蔻酸异丙酯（IPM）按1∶1的比例加入烧杯中，搅拌均匀以后再依次加入Tween 80和丙三醇，把蒸馏水逐滴地加入正在磁力搅拌的预混料中。并且在开始加入蒸馏水后，把电导率仪放入烧杯里面，不断观察电导率的变化并记录，当电导率出现最大值时，停止水相的加入，并且记录下蒸馏水的用量。计算出油相、乳化剂和水相三相的质量分数，并以此为基础在伪三元相图标记为点，这些点的覆盖面积就是所形成的微乳区域面积（Microemulsion Area，ME）。在此基础上，根据最大的微乳区域面积来选择合适的组成和工艺条件。

1.3.2 表面活性剂和助表面活性剂的质量（Km）的选择

据1.3.1的实验步骤，在固定温度下，选择不同Km值（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，w／w）制备微乳并绘制伪三元相图，选择出合适的Km值。

1.3.3 温度对肉桂油微乳制备的影响

分别于25℃，40℃，50℃的温度下制备微乳，根据伪三元相图微乳区域的大小来确定最佳温度。

1.3.4 肉桂油微乳配方的优化

CO／IPM（1∶1，w／w）作为混合油相，无水乙醇／丙三醇（1∶1，w／w）作为混合助表面活性剂，选择Span 80和EL-40为表面活性剂分别与Tween 80进行复配，固定Km=4，在40℃下，根据1.3.1节的方法制备O／W型肉桂油微乳。

1.3.5 微乳的判别及类型鉴别

将制备的澄清体系在4 000r·min-1条件下离心20min，通过观察是否出现分层或者沉淀，来判断微乳的形成。在制得的微乳体系中加入红色的油溶性染料苏丹Ⅲ和蓝色的水溶性染料亚甲基蓝，观察两种染料在微乳中的扩散速度，判断微乳的类型［24］。

1.3.6 COME理化参数的测定

利用NICOMP380ZL型激光纳米粒度测定仪、DDS-307电导率仪以及WYA-2W型阿贝折射仪分别对肉桂油微乳的粒径、平均分布、电导率和折光度进行测定。

1.3.7 肉桂油中肉桂醛的检测［25］

液相色谱条件：色谱柱C18，5μm，4.6mm×250mm；流动相乙腈-0.1%磷酸溶液（33∶67）；柱温25℃；进样量20μL；流速1.0mL·min-1；检测波长285nm。

工作曲线的制备：精密称量0.020 0g肉桂醛对照品，用甲醇溶解后，转移至25mL容量瓶中并定容，得到800μg·mL-1的肉桂醛储备液。用甲醇将储备液稀释成系列质量浓度为20，40，60，80，100，120，140，160μg·mL-1的对照品溶液，取20 μL进样，按照色谱条件检测肉桂醛含量，每个浓度进样3次，以肉桂醛对照品浓度（x）对峰面积（y）作图，绘制标准曲线。

COME供试品溶液：精密称取4.00g COME，加入一定质量的无水硫酸钠，破乳后取上清液，用甲醇适当稀释，过0.45μm微孔滤膜，得到COME供试品溶液。

1.3.8 肉桂油微乳稳定性考察

分别通过离心试验、加热-冷却循环实验、贮藏试验考察所制备的微乳配方的稳定性。

1.3.9 体外释放实验

人工肠液的配制（SIF）［26-27］：精确称量磷酸氢二钾（KH2PO4）6.8g，加蒸馏水溶解，移至500mL容量瓶并用蒸馏水定容。用浓度为0.1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至6.8或者7.4；取胰酶10 g，加适量蒸馏水量溶解，将两液混合均匀，移至1 000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即得pH 6.8和7.4的人工肠液。

三角瓶里面加入一定体积的SIF，以100 r·min-1的速度震荡并且温度保持在37℃±0.5℃。取20mL肉桂油微乳放入透析袋中，两端用绳子扎紧后放进三角瓶里面。以固定的时间间隔从三角瓶中取样，取样后立刻向三角瓶中加入同体积的相同温度的人工肠液。参照1.3.7的方法对样品进行破乳并稀释，测定肉桂醛含量，计算释放液中肉桂醛含量。空白乳液的释放介质溶液同法处理。累积释放速率用下式计算：

式中：Q为累积释放百分数（%）；V0为释放介质溶液总体积（mL）；V为取样体积（mL）；Ct为在释放时间点测定的释放介质溶液中肉桂醛的浓度（mg·mL-1）；C为在前一个释放时间点测定的释放介质溶液中肉桂醛的浓度（mg·mL-1）；W为被包封的肉桂醛的总质量（mg）。

1.4 数据分析

数据采用Origin 7.5进行分析。

2 结果与讨论

2.1 微乳配方的筛选

2.1.1 最佳Km值

通过比较伪三元相图微乳区域大小来考察Km值（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，w／w）对微乳液制备的影响（图1）。当Km=1时，只有部分比例可以形成微乳，构成的微乳区域最小。当Km值为2，3和4时，在8∶1～4∶1都可以形成微乳，且微乳面积随着Km值的增加而增大。这有可能是因为助表面活性剂虽然可以降低界面张力，但是当助表面活性剂过量时，也相对地使表面活性剂的量减少了，从而乳化的能力也相应地降低，并且还会使混合膜的强度和稳定性降低，因此不利于微乳的形成［28］。因此确定最佳Km为4。

2.1.2 乳化温度的选择

根据2.1.1的实验结果，固定搅拌速度，考察乳化温度（25℃，40℃，50℃）对肉桂油微乳液制备的影响（图2）。随实验温度的升高，ME先增加后减小。40℃的微乳区域面积最大，为最佳温度。这可能是因为升高温度可以加快分子的运动速度，能够促进水油两相与混合膜的相互作用，从而降低界面表面张力，更有利于形成微乳［29］。但是，当乳化温度为50℃时，微乳制备过程中肉桂油的挥发不利于微乳的形成，因此形成的肉桂油微乳的面积变小。

2.1.3 肉桂油微乳配方的优化

不同种类的表面活性剂的复合使用可以调节其HLB值，并且形成一种更为坚固的复合凝聚膜，从而增加微乳的稳定性［30-31］。因此，选取Span 80或者EL-40分别与Tween 80进行复配，结果如表1。Tween 80／Span 80组合无法形成微乳，而Tween 80／EL-40组合都能够形成澄清透明的体系，且经过4 000r·min-1，20min离心后没有出现相分离。

2.2 肉桂油微乳类型鉴定及理化性质

由2.1得出的最佳微乳制备条件为乳化温度40℃，固定Km=4，所得最佳微乳配方为CO／IPM／Tween 80／EL 40／无水乙醇／丙三醇／水，其中CO／IPM=1∶1（w／w），Tween 80／EL-40=3∶1（w／w），无水乙醇／丙三醇=1∶1（w／w），蒸馏水含量为64.29%，肉桂油的最大含量为3.57%。将所制备的微乳在4 000r·min-1下离心20min，没有出现相分离，初步表明所制备的乳液为微乳。如图3，优化以后的配方制备的乳液平均粒径是14.6nm，多分布指数为0.111，进一步表明形成了微乳。

表1 Tween 80与不同种类表面活性剂复配形成的COME

在微乳液中滴加亚甲基蓝和苏丹红染色液，比较扩散速度发现，水溶性亚甲基蓝的扩散速度快，说明制得的样品为O／W型。O／W型、双连续（BC）型和W／O型，这3种微乳可以在形成过程中通过电导率来区分［32］。所制备的微乳液电导率为228μs·cm-1，这是因为COME的连续相是水，电导率相对来说比较高。微乳的折光率（RI）为1.3829，接近水相的折射率，也进一步证明形成了O／W型肉桂油微乳。样品离心后，没有出现沉淀、乳化和相分离的现象，说明样品具有较好的物理稳定性，构建的微乳体系良好。

2.3 肉桂醛标准曲线

在1.3.7节色谱条件下，对肉桂醛对照品溶液和COME供试品溶液进行HPLC检测，结果如图4，肉桂醛保留时间为（16.700±0.200）min，所得线性回归方程为y=162.7x+169，R2=0.998，表明肉桂醛浓度在20μg·mL-1～160μg·mL-1范围内线性良好。经计算，COME中肉桂醛含量为24.05mg·g-1。

2.4 肉桂油微乳的稳定性

2.4.1 离心稳定性

以10 000r·min-1离心30min，微乳外观依然澄清透明，没有出现沉淀、乳化，说明制备的微乳离心稳定性良好。

2.4.2 冷热循环稳定性

将肉桂油微乳在40℃的条件下放置12h，取出后再在4℃温度下放置12h，作为1次加热-冷却循环。肉桂油微乳经过5次加热冷却循环后，没有发生破乳、聚结和相分离，依然保持着良好的稳定性。

2.4.3 贮藏稳定性

将制备的肉桂油装入密闭的容器中，30℃±2℃下放置6个月，期间测定其理化性质、肉桂醛含量并目测微乳形态，结果如图5。0～6个月间，微乳体系pH略有下降，这可能是因为在储藏过程中，微乳体系中的肉桂醛被氧化为肉桂酸，导致pH值变小。微乳体系的电导率呈先增大后减小的趋势，在0～1个月间增加较大，1～6个月间变化较小。在贮藏过程中，微乳体系的折光率变化并不明显。微乳中的肉桂醛含量在贮藏期间只稍微降低，6个月之后，微乳中肉桂醛的保留率高达92.79%。而同等条件下，普通肉桂油的保留率仅有46.52%。实验结果说明，微乳体系可以成功地提高肉桂油的稳定性。

2.5 pH对肉桂油释放速率的影响

从图6可以看出，肉桂油微乳在pH 6.8和pH 7.4的人工肠液中的累计释放率都随着时间而增加。在8h时，肉桂油在pH 6.8的人工肠液中的释放率达到了31.21%，而在pH 7.4中只有18.62%，说明不同的pH值对肉桂油微乳的体外释放行为有影响。从释放总量来看，到8h时，两种介质中的释放总量都不到一半，这说明还有释放的可能，8h后的释放情况还有待进一步研究。

2.6 体外释放动力学模型的建立

绘制累积释放率与时间的关系并用5个经验方程来拟合（图6），分析肉桂油微乳在两种不同释放介质中的释放动力学。在不同的pH条件下，由5个动力学方程分别得到R2（表2，3）。

通过比较R2值表明，在pH 6.8和pH 7.4SIF中，Retger-peppas方程的拟合都优于其他4个动力学方程。这些结果显示Retger-peppas方程适合COME的释放拟合。

表2 COME在pH 6.8人工肠液中的释放动力学模型建立结果

表3 COME在pH 7.4人工肠液中的释放动力学模型建立结果

通过Retger-peppas方程，可以研究肉桂油释放的机理和动力学。方程如下式：Q=k×tn

其中k是系统的动力学常数，n是扩散指数，是分析释放速率机制的重要参数［33］。肉桂油微乳在两种pH的人工肠液中的n值都介于0.45和0.85之间，表明肉桂油的释放属于非Fickian扩散机制，依赖于药物扩散和聚合物松弛的共同作用，药物释放的过程加快，因此高于Fickian释放［33-34］。k值与释放速度动力学有关，k值越高，药物的释放速度越快［35］。

表4总结了肉桂油在pH 6.8和pH 7.4释放的k值和n值。可以看出，在pH 6.8的人工肠液中，释放的k值（8.663 58）大于7.4的人工肠液（3.868 59）。这说明肉桂油微乳在酸性环境中比在碱性环境中释放的更快，这与累计释放百分数Q的结果是一致的。

表4 pH 6.8和pH 7.4人工肠液中COME的扩散指数（n）和扩散常数（k）

3 结论

本研究制备了O／W型肉桂油微乳，确定最佳配方为CO／IPM／Tween 80／EL 40／无水乙醇／丙三醇／水体系，其中 Tween 80／EL-40=3∶1（w／w），无水乙醇／丙三醇=1∶1（w／w），Km=4，最佳制备温度为40℃，肉桂油含量为3.57%，经染色法鉴定为O／W型微乳。结果表明，肉桂油微乳具有良好的离心稳定性，冷热循环稳定性和储藏稳定性，在贮藏6个月以后，肉桂油微乳中肉桂醛的保留率较普通肉桂油提高了1倍，表明将肉桂油制成微乳是解决肉桂油易氧化、易挥发问题的有效方法。

体外释放实验及释放动力学模型拟合方面的的结果表明，肉桂油在pH 6.8人工肠液中的释放速率比pH 7.8人工肠液更快，两种介质中的释放动力学都与Retger-peppas方程拟合度最高，释放机制属于非Fickian释放。全面地考察肉桂油微乳的生物利用度，有待于对肉桂油微乳的肠吸收情况做进一步研究。