响应面法优化喷雾干燥制备乳酸菌发酵枸杞粉工艺

程浩，秦小彤，熊 涛

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

近年来，随着对健康食品需求的增加使得新型功能性产品得到迅速发展，出现了大量非乳制品基功能性产品，益生菌发酵果蔬汁就是其中之一。使用乳酸菌将果蔬汁制成发酵饮料能够在保留原有果蔬特有风味的同时，改良口感并赋予其更高的营养价值［1-2］。但是含活菌的发酵果蔬汁货架期较短，且需在冷链下流通，而将其制成发酵果蔬粉则能够延长保质期，降低运输成本。果蔬粉可以应用于食品加工的各个行业，如饮料、食品、医药保健品等［3］。

使用喷雾干燥技术制备发酵果蔬粉具有能耗低，处理量较大且易于放大等优点。但由于富含低分子量糖，果蔬汁在喷雾干燥过程中粘壁严重，产品中含水量较高［4］。同时，整个工艺过程中益生菌活力的保持也是一个艰巨的挑战［5］。因此为保证益生菌果蔬粉的质量，除了选择合适的助干剂，还必须优化喷雾干燥过程的工艺参数。

目前关于喷雾干燥制备益生菌发酵果蔬粉的研究报道较少且主要集中在国外，Mestry等［6］首次提出喷雾干燥制备胡萝卜西瓜混合发酵果粉，对理化性质、生物学性质和溶解性进行优化，得到最优工艺条件为进风温度144℃，进料流速5mL·min-1，雾化压力1kg·m-2。Kingwatee等［7］研究了不同出风温度和载体对益生菌荔枝粉理化性质的影响，发现出风温度80℃条件下，以15%麦芽糊精和5%菊粉为载体，能够得到活菌数6.11log CFU·g-1，含水率为2.34%的益生菌荔枝粉。但是国内关于喷雾干燥制备益生菌发酵果蔬粉的研究鲜见报道。

现代医学研究证实，枸杞具有补肾养肝、润肺明目、增强免疫力、防衰老、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳及协同防癌等多方面的药理作用［8-11］。本文以植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）为起始菌株，对复水枸杞汁进行发酵，研究了喷雾干燥工艺条件对乳酸菌发酵枸杞粉的含水率、活菌数及集粉率的影响，再通过响应面试验设计，以含水率、活菌数及集粉率为响应值，对喷雾干燥工艺参数进行优化，为益生菌发酵果蔬粉相关产品的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）NCU137，由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室保藏；宁夏枸杞，银川杞里香商贸有限公司；麦芽糊精（食品级），麦芽糖醇（食品级）；MRS培养基：牛肉膏，酵母粉等。

1.2 仪器与设备

B-290小型喷雾干燥仪（瑞士步琪公司）；JSM-6701F场发射扫描电子显微镜（日本电子株式会社）；PB203-N分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；MJ-BL25C3打浆机（美的集团股份有限公司）；GYB高压均质机（上海华东高压均质机厂）；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；ZSD-A1160A生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

枸杞挑选→浸泡→打浆去籽→均质→稀释→灭菌→接种→发酵→加入载体、喷雾干燥→产品

1.3.2 乳酸菌枸杞汁的制备

干枸杞1∶3复水浸泡30min，使用打浆机打浆去籽，30MPa高压均质3次，即为原浆。原浆∶水（w／w）=3∶7稀释，102℃灭菌20min，冷却。向冷却至室温的枸杞汁中接入植物乳杆菌NCU137菌剂（活菌数为11.2log CFU·g-1），接种量为总体积的万分之五（w／v），摇匀后于37℃恒温培养箱培养28h，得到发酵枸杞汁（活菌数为8.5log CFU·mL-1）。

1.3.3 物料制备

以原浆体积20%麦芽糊精和8%麦芽糖醇作为载体加入枸杞汁，搅拌20min至充分溶解后，进行喷雾干燥试验。

1.3.4 喷雾干燥工艺单因素试验

在大量预实验基础上，确定喷雾干燥工艺参数点，通过单因素试验，确定合适的工艺参数范围。

1.3.4.1 进风温度

在进料流速400mL·h-1，气流量470L·h-1条件下，分别选择进风温度110℃，120℃，130℃，140℃，150℃进行喷雾干燥，测定含水率、活菌数和集粉率。

1.3.4.2 进料流速

在进风温度120℃，气流量470L·h-1条件下，分别选择进料流速240，320，400，480，560mL·h-1进行喷雾干燥，测定含水率、活菌数和集粉率。

1.3.4.3 气流量

在进风温度120℃，进料流速400mL·h-1条件下，分别选择气流量350，410，470，530，590L·h-1进行喷雾干燥，测定含水率、活菌数和集粉率。

1.3.5 响应面实验设计

根据单因素试验结果，采用3因素3水平的Box-Behnken试验设计，以进风温度进料流速和气流量为因素，含水率、活菌数、集粉率为响应值，对乳酸菌发酵枸杞粉的喷雾干燥工艺进行优化，因素与水平设计见表1。

1.4 颗粒形貌观察

利用环境扫描电子显微镜（SEM）观察乳酸菌发酵枸杞粉的微观形态，取双面导电胶置于载物台上，用牙签挑取少量样品涂于导电胶上，置于电子显微镜样品室中，电子枪加速电压为10kV，选择合适的放大倍数对样品进行扫描观察并拍照。

1.5 指标测定及计算

1.5.1 活菌计数

将0.1g乳酸菌发酵枸杞粉加入9.9mL 0.01 mol·L-1的PBS中，振荡混匀、梯度稀释、涂布于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养48h后进行菌落计数，记为CFU·g-1。

1.5.2 含水率的测定

参考 GB 5009.3—2016［12］，准确称取2g乳酸菌发酵枸杞粉于烘干至恒重的称量瓶中，102℃烘干4h，取出置于干燥器内，冷却称重，再置于102℃烘0.5h，取出冷却称重，重复至减重不超过2mg。含水率计算公式如下：

1.5.3 集粉率的测定

集粉率即产率，由喷雾干燥所得粉末的质量比上喷雾干燥前物料所含总固形物的质量，具体公式如下［13］：

1.6 数据处理

每个试验重复3次，实验结果以平均值±标准差表示。Box-Behnken响应面试验使用Design-expert 8.0.6设计分析。响应面试验数据使用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

含水率和活菌数为发酵果蔬粉产品最重要的指标，果蔬粉含水率必须低于6%［3］，而益生菌产品的活菌数必须高于6log CFU·g-1［14］，集粉率越高生产效率越高，综合考虑含水率、活菌数和集粉率结果，以得到较优的实验范围。

2.1.1 进风温度对乳酸菌发酵枸杞粉粉末性质的影响

由表2可知，随着进风温度的升高，含水率逐渐下降，活菌数和集粉率都是先上升后下降。这是由于进风温度的上升，使得雾滴与热风之间的温度梯度增大，传热速率加快，从而加速水分的蒸发，使得粉末的含水率下降。喷雾干燥过程中的雾滴干燥分为恒速干燥和降速干燥两个阶段［15］，在恒速干燥阶段，雾滴表面湿润，内部温度较低，对菌体活性影响较小，而在降速干燥阶段颗粒内部逐渐升温，进风温度越高恒速干燥阶段越短，降速干燥时间延长，从而使得颗粒内部温度过高，导致菌体大量失活。进风温度较低时，雾滴干燥不充分，会出现粘壁现象，而进风温度过高会使得粉末发生玻璃化转变粘附于干燥室内，这都会导致集粉率的降低［16］。根据单因素试验结果，由于进风温度高于130℃后，活菌数过低，因此选取110℃，120℃和130℃为响应面试验水平。

表2 进风口温度对乳酸菌发酵枸杞粉粉末性质的影响

2.1.2 进料流速对乳酸菌发酵枸杞粉粉末性质的影响

由表3可知，随着进料流速的增加，含水率逐渐上升，活菌数先上升后下降，集粉率逐渐下降。这是由于进料流速的上升，使得雾滴变大，比表面积减小，传质传热速率降低，导致含水率逐渐上升。进料速度较低时，雾滴较小，水分蒸发过快，使得干燥颗粒过热，因此存活率较低，而随着进料速度逐渐上升，雾滴逐渐变大，蒸发足够的水分使得颗粒不会过热，但进料流速过高会导致雾化效果变差，雾滴比表面积减小，水分蒸发减慢，使得液滴温度升高，活菌数降低。随着进料流速的上升，雾滴干燥不充分，使得粘壁程度加重，导致集粉率逐渐降低［17］。根据单因素实验结果，由于进料流速为240mL·h-1时，活菌数过低，而560mL·h-1时，含水率过高，因此选取320，400，480mL·h-1作为响应面试验水平。

表3 进料流速对乳酸菌发酵枸杞粉粉末性质的影响

2.1.3 气流量对乳酸菌发酵枸杞粉粉末性质的影响

由表4可知，随着气流量的上升，含水率先下降后上升，菌体存活率先上升再下降再上升，而集粉率先上升后下降。这是由于低气流量下，雾化效果差，雾滴经过干燥室时，干燥不完全导致含水率较高，随着气流量的上升含水率会逐渐下降，而过高的气流量会减少颗粒在干燥室内的停留时间，导致含水率上升。低气流量使得雾滴停留时间较长，导致雾滴温度过高，因此存活率较低，而随着气流量的上升，雾滴逐渐变细，水分蒸发加快，防止过热风险，使得存活率升高，而在470L·h-1条件下，雾化效果较优，但由于在塔内的停留时间较长，使得颗粒温度上升，因此存活率降低。随着气流量的继续上升，雾滴在干燥室内的停留时间减少，同时由于雾化效果较好，不存在过热风险，存活率较高。同时，集粉率与含水率呈负相关，含水率越高粘壁程度越高，集粉率越低。结果表明：气流量470L·h-1时，含水率处于最低点，集粉率处于最高点，同时活菌数接近7 log CFU·g-1，因此选择410，470，530L·h-1作为响应面试验水平。

表4 气流量对乳酸菌发酵枸杞粉粉末性质的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

以进风温度、进料流速和进气量为因素，以含水率、活菌数和集粉率为响应值，进行Box-Behnken响应面试验，对喷雾干燥制备乳酸菌发酵枸杞粉工艺进行优化。试验方案及结果见表5。

表5 响应面试验设计方案及结果

由回归分析结果得到乳酸菌发酵枸杞粉的含水率预测值对进风温度、进料流速、气流量3个因素的二次多项回归方程如下：

由表6可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），由一次项F值可知各因素对枸杞粉含水率影响程度为：进料流速＞进风温度＞气流量。A、B项对含水率的影响极显著，A2，B2，C2，AB项对含水率的影响显著，其余项对含水率的影响不显著。回归模型中的相关系数R2和R2Adj分别为0.939 7和0.862 2，模型的信噪比为13.788，一般认为模型的可接受信噪比大于4，说明模型的拟合度和可信度较高；变异系数越小说明试验可靠性越高，变异系数不能高于10%［17］，该模型的变异系数为4.40%，说明试验可靠性良好。因此可用此回归方程预测乳酸菌发酵枸杞粉的含水率。

由回归分析结果得到乳酸菌发酵枸杞粉活菌数的预测值对进风温度、进料流速、气流量3个因素的二次多项回归方程如下：

表6 回归模型方差分析／含水率

由表7可知，模型极显著，失拟项不显著，由一次项F值可知各因素对活菌数影响程度为：进风温度＞进料流速＞气流量。A，B，A2，C2，AB项对存活率影响极显著，AC项对存活率影响显著，其余项对存活率影响不显著。回归模型中的相关系数R2和分别为0.932 2和0.845 0，模型的信噪比为13.768，变异系数为2.89%，说明模型的拟合度、可信度较高，可靠性良好，可用此回归方程预测乳酸菌发酵枸杞粉的活菌数。

表7 回归模型方差分析／活菌数

由回归分析结果得到乳酸菌发酵枸杞粉的集粉率预测值对进风温度、进料流速、气流量3个因素的二次多项回归方程如下：

由表8可知，模型极显著，失拟项不显著，由一次项F值可知各因素对粉末集粉率影响程度为：进料流速＞进风温度＞气流量。A、B、BC项对集粉率影响极显著，C、C2项对集粉率影响显著，其余项对集粉率影响不显著。回归模型中的相关系数R2和R2Adj分别为0.978 7和0.951 3，模型的信噪比为23.953，变异系数为2.50%，说明模型的拟合度、可信度较高，可靠性良好。可用此回归方程预测喷雾干燥乳酸菌发酵枸杞粉的集粉率。

2.2.2 各因素间相互作用响应面分析

根据各回归模型的方差分析结果，选出影响显著的交互项进行响应面分析，从而更直观的观察交互项对乳酸菌发酵枸杞粉各指标的影响。

由图1可以看出，固定气流量为470L·h-1，含水率随着进风温度的升高逐渐下降，随进料流速的上升而上升。在进风温度120℃～130℃，进料流速240～310mL·h-1范围内，存在最低点，同时，等高线呈椭圆形［18］，也能说明进风温度和进料流速 的交互作用对含水率的影响显著。

表8 回归模型方差分析／集粉率

由图2（a）可以看出，固定气流量为470L·h-1，活菌数随着进风温度的升高，先上升后下降。在低进风温度下，随着进料速度的增加而降低。在高进风温度下，随着进料速度得增加而增加。由图2（b）可以看出，固定进料速度400mL·h-1，活菌数随进风温度的升高，先上升后下降。在低进风温度下，随着气流量的上升，先降后升，而在高进风温度下，随着气流量的上升而上升。由响应曲面可直观的看出AB比AC更陡峭，说明AB的交互作用比AC的交互作用对活菌数的影响大。

由图3可以看出，固定进风温度为120℃，集粉率随着进料流速的增加逐渐减小。在低进料速度下，随着气流量的升高，集粉率逐渐下降。而在高进料速度下，集粉率随着气流量的升高而升高。说明进料流度和气流量的交互作用对集粉率的影响显著。

2.3 最佳喷雾干燥条件的确定及验证实验

使用Design-Expert V8.0.6软件，以含水率取最小，活菌数和和集粉率取最大为目标，对喷雾干燥益生菌发酵枸杞粉工艺条件进行优化，得到最优参数为进风温度117.88℃、进料速度320mL·h-1、气流量427.51L·h-1，含水率预测值为5.53%，活菌数预测值为7.62log CFU·g-1，集粉率预测值为55.15%。以最终优化所得工艺条件进行验证，设置进风温度118℃，进料流速320mL·h-1，气流量428L·h-1，所得乳酸菌发酵枸杞粉的含水率为5.412%±0.209%，活菌数为7.534±0.138log CFU·g-1，集粉率为55.61%±2.4%，实验结果与预测值接近，说明优化结果可靠。

Pereira等［19］使用两种载体配方对干酪乳杆菌发酵腰果梨汁进行喷雾干燥，初始活菌数为8.35 log CFU·mL-1，最终所得粉末活菌数分别为6.4和6.8log CFU·g-1，Anekella等［20］在使用树莓汁对益生菌进行微囊化的研究中，优化范围内的集粉率均低于50%。说明在此工艺条件下制备的乳酸菌发酵枸杞粉含水率符合标准，活菌数和集粉率都较高。

2.4 颗粒形貌观察

如图4所示，乳酸菌发酵枸杞粉颗粒呈大小不同的球形，颗粒表面有凹陷和褶皱，这是由于喷雾干燥过程中高温使得水分迅速蒸发导致的，同时未观察到乳酸菌菌体说明包埋效果较好。颗粒表面无裂纹，可避免喷雾干燥过程中菌体受到高温损伤，并有效防止乳酸菌发酵枸杞粉储藏过程中发生脂质过氧化［21］。

3 结论

由于不同产地枸杞的营养成分不同，喷雾干燥效果不同，因此本文仅针对宁夏枸杞进行研究。通过对回归模型的方差分析可知，对喷雾干燥乳酸菌发酵枸杞粉的含水率和集粉率影响最大的是进料流速，其次是进风温度，气流量影响最小。而对于喷雾干燥乳酸菌发酵枸杞粉的活菌数而言，进风温度影响最大，其次是进料流速。经过响应面优化，得到最优喷雾干燥条件为进风温度117.88℃、进料速度320mL·h-1、气流量427.51L·h-1，采用上述最优条件制备的乳酸菌发酵枸杞粉，实际含水率为5.412%，活菌数为7.534log CFU·g-1，集粉率为55.61%，与预测值接近，工艺参数可靠，可为益生菌发酵果蔬粉相关产品的研发提供理论依据。