碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因型分析

徐淑晔，郭政新

肠杆菌科细菌是医院感染的常见病原体。碳青霉烯类药物是治疗革兰阴性杆菌特别是肠杆菌科细菌感染最强效的β内酰胺类抗生素[1]。由于抗生素的不合理的应用[2]，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌随之出现，尤其以耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae,CRKP)最为严重[3]，由CRKP引起的院内感染因其高传播率、高病死率、高耐药率引起广泛关注[4- 5]。我院近年来CRKP感染的患者逐渐增多，细菌耐药形势较为严峻。为了防止我院CRKP的扩散，了解我院流行菌株背景是前提[6]。本文拟通过全基因组测序[7]，以MLST、核心基因组多位点序列分型(core genome multilocus sequence typing,cgMLST)和构建最小生成树(minimum spanning tree,MST)等手段系统的分析了本院院内感染流行菌株的特点，为医院感染防控提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集蚌埠市第三人民医院2018年11月—2019年3月临床标本分离得到的CRKP(对于任一种碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯即认为CRKP)21株，剔除同一患者、同一部位的重复分离株。

1.2 仪器与试剂 Vitek 2 Compact 全自动细菌药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)及配套革兰阴性菌的鉴定卡(Vitek-GN)。MH干粉培养基，恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)， Bio-Rad电泳仪 (Bio-Rad公司,美国)，超微量分光光度计(Biochrom公司、英国)，美国Bio-Rad凝胶成像系统，细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，DNA Marker D，4S Red plus 核酸染色剂，上样缓冲液均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 菌株鉴定及药敏实验 所有菌株使用法国生物梅里埃Vitek 2 Compact 全自动细菌药敏分析仪及配套革兰阴性菌的鉴定卡(AST-GN13)进行细菌鉴定和药敏实验，结果判定根据美国临床实验室标准化协会 (CLSI) 2017年推荐的标准执行。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705购自卫生部临床检验中心。

1.4 菌株基因组提取、测序、组装 在无菌试管中加入3 mL LB培养基，挑取单克隆菌落加入LB培养基中，经37℃、220 rpm摇菌过夜。取浑浊的菌液2 mL, 12 000 rmp离心2 min，弃上清后用DNA提取试剂盒提取菌株DNA。回收得到产物分别用琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测纯度和浓度，产物OD260∶OD280在1.8～2.0范围之内并且基因组条带清晰完整、无明显RNA条带视为样品合格[8]。将DNA浓度≥20 ng/μL,总量大于600 ng的样品送往上海生工生物有限公司。通过illumina Hiseq2500测序平台对21株CRKP进行全基因组测序,在Linnux系统下运行SPAdes-2.0软件拼接原始数据[9]。

1.5 菌株耐药基因分析及MLST的分型 应用staramr软件对比ResFinder, PointFinder和PlasmidFinder数据库来扫描组装菌株基因，确定细菌耐药基因型[10]；采用MLST软件根据肺炎克雷伯基因组上的7个管家基因，比对并确定给出菌株对应的ST分型[11]。

1.6 cgMLST分型及MST构建 采用Ridom SeqSphere+软件进行cgMLST分型及MST构建(cgMLST是 MLST 的一个拓展方法)，以www.cgMLST.org网站上公布的2358个基因作为参考核心基因组，以基因比对的方式搜寻基因序列的差异,并且赋予每株菌一组等位基因编号，分型确定CT(complex type)型别。MST是可视化的描述菌株之间进化关系，利用Ridom SeqSphere+把每个菌株基因与2358个核心基因组进行比对，确定对应菌株的等位基因图谱，标记每个菌株等位基因图谱间相差的等位基因数。本资料将密切相关的基因型(有15个等位基因，差异的等位基因个数是Ridom SeqSphere+软件自定义)差异以内的菌株归为同一簇[12-13]。在同一簇的菌株之间相差1～15个等位基因不等，相差的等位基因少则意味着亲缘关系近。

2 结果

2.1 CRKP菌株的科室分布 21株CRKP 14株来源于痰液，3株来源于血液，3株来源于尿液；21株菌来源于9个不同的临床科室，其中重症医学科11株，占52.38%。见表1。

表1 21株CRKP科室分布

2.2 药敏试验结果 21株CRKP对特殊级抗菌药物亚胺培南及头孢菌素类、青霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类等常规药物耐药率均为100%，对复方磺胺甲噁唑耐药率为95.24%，而对四环素的耐药率为14.29%。见表2。

表2 21株CRKP对抗菌药物耐药情况

2.3 菌株ST分型和耐药基因谱分析结果 21株CRKP的 MLST分型均为ST11型，均携带KPC-2耐药基因；blaSHV、blaCTX-M-65、blaTEM-1B、blaOXA-1携带ESBLs基因，每株携带2种以上；15株CRKP携带AmpC耐药基因blaDHA-1；检测出氨基糖苷类耐药基因有rmtB、aadA2、aac(3)-Ⅱd、armA；喹诺酮类耐药基因有qnrB4和qnrS1；磺胺类耐药基因：sul，四环素类耐药基因：tet(A)。见表3。

表3 21株CRKP耐药基因谱及其占比

2.4 cgMLST分型及MST生成 21株菌株经过cgMLST分型共被分为5个谱型。CT3176型共有14株，占比66.67%。其它分别为CT1689(3株)、CT1313(2株)、CT1814(1株)和CT3195(1株)，见表4。在MST中21株菌株根据15个等位基因阈值被分为3簇，第1簇为CT3176型，为主要的优势型别。该簇中4、35和7号菌株因位于簇的中心，周围菌株与其具有1～15个等位基因的差别，可被认为与周围菌株有密切的进化关系。同时18与36号没有等位基因的差别，则被标记为同一个圈。4号与35号菌株情况与此相同。2株CT1689型构成第2簇，两者相差7个等位基因。另外2株CT1313形成第3簇，有2个等位基因的差别。而其它15、28、32号因为等位基因超出15个阈值，菌株没有成簇，与其他菌株之间亲缘关系较远。见图1。

表4 21株CRKP cgMLST分型结果

图1 基于21个肺炎克雷伯菌菌株的cgMLST等位基因谱生成的最小生成树注：每个圆圈代表一个基于2358个cgMLST靶基因的序列分析的等位基因图谱。连接线上的数字表示具有不同等位基因的靶基因的数量。 圆圈的颜色代表不同的CT型。密切相关的基因型(15个等位基因的差异)被阴影化，即被分为一簇被连续编号(1～3)。

3 讨论

CRKP的耐药机制主要是碳青霉烯酶的产生[14],本次调查的21株菌株均产生KPC-2酶，同时发现产酶菌株不仅对β-内酰胺类药物耐药，而且同时对氨基糖苷类、喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物100%耐药。21株菌株均检出氨基糖苷类耐药基因aac(3)-Ⅱd、aadA2、armA、rmtB与对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的100%耐药结果相一致；喹诺酮类耐药基因：qnrB4、qnrS1(qnrB4阳性率71.43%;qnrS1检出率9.52%)检出情况,小于环丙沙星、左氧氟沙星(耐药率100%)的药敏结果,可能与其他抗菌药物耐药基因的高水平表达起协同耐药的作用。其他的如磺胺类:sul、四环素类:tet(A)耐药基因均与药敏结果表型相一致。这势必给临床治疗带来困难，所以必须严格执行防控措施,控制耐药菌株的流行。

目前对CRKP的基因分型方法主要包括脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)[15]、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)。在这些方法中PFGE被认为细菌分子分型的“金标准”[16]，该方法的主要缺点是操作复杂，耗时长同时还受实验环境、操作人员等因素影响，且不同批次之间可比性较差[17]；MLST是通过比对7个管家基因序列的分型方法，其操作简单，可比性强，但是分辨率不高[18]。基于全基因组测序的cgMLST分型方法是用肺炎克雷伯菌核心基因组中的上千个基因序列差异，对菌株进行区分和分型，具有很好分辨力、重复性和实验室间可比性,便于建立公共数据库,实现标准化的应用[19-22]。对本院的21株CRKP的基因组分型后发现：cgMLST分型将均为ST11型菌株分为不同亚型，提示ST11型的不均一性。

根据等位基因的差别个数构建的MST，能把进化关系近的菌株聚集成簇，并且区分开亲缘关系较远的菌株[23]。本调查对本院连续5个月收集的21株CRKP进行了分析，从MST图中可以看出，在第1簇中CT3176型为本院的优势型别,并且4、35、7号菌株与其周围菌株形成一定范围的进化关系，即在院内引起了一定范围内的播散。在第2簇和第3簇中具有密切进化关系的菌株数量较少，也没有形成较为大的播散。所以针对CT3176型别的CRKP必须辅以详细的流行病学调查和分析，以明确感染源和传播途径，便于及时采取针对性的防控方案，阻止CT3176型的菌株造成更大的播散甚至是院内感染暴发。针对其他簇中或暂时还没有形成簇的菌株也需以积极的采取措施，以防成为优势型别或一定范围的播散。所以实时监控医院的CRKP的MST不仅可以及时有效的发现院内感染播散的源头、趋势，也可以检测医院感染控制工作的成效，其主要体现在优势型别的菌群由聚集成簇变为分散状态。此外使用全基因组测序技术，利用cgMLST分型和MST图能快速准确区分高度相关的病原体谱系，及时证实或排除医院感染暴发[22-23]。所以通过CRKP基因组的分型对以往的菌株进行分析，可为以后院感工作提供参考，更为潜在暴发的甄别提供判断依据[24]。