2型糖尿病合并冠心病患者微小RNA-30a和几丁质酶-3样蛋白-1水平变化及其与冠状动脉病变的相关性

秦少华 王新舜 杜玉祥 曹宝国

糖尿病是冠心病(CAD)的等危症，二者彼此独立又相互联系。2018年美国糖尿病协会发布的指南[1]推荐，对于糖尿病合并无症状CAD患者，在有效控制心血管疾病危险因素的前提下，A级证据并不推荐将冠状动脉(简称冠脉)检查用于糖尿病患者筛查CAD。慢性炎症反应是糖尿病和CAD共同的病理基础。Li等[2]发现炎症因子可刺激血管壁局部活化的特定颗粒细胞大量分泌几丁质酶-3样蛋白-1(YKL-40)，通过促进血管内皮细胞的粘附、趋化、迁移等损伤血管内皮功能及细胞外基质重建，从而参与动脉粥样硬化斑块的形成和进展。既往研究结果显示，微小RNA(miRNA，miR)-30a参与炎症反应和内皮细胞凋亡过程[3-4]。由此可见，miR-30a和YKL-40均与慢性炎症反应相关。我们通过探讨血清miR-30a和YKL-40在糖尿病合并CAD患者中的表达情况及其在冠脉病变过程中的作用，旨在为评估糖尿病合并CAD患者冠脉病变严重程度提供辅助参考依据。

对象与方法

1.对象：2018年1月～12月因不明原因胸痛于我院行冠脉造影(CAG)的2型糖尿病(T2DM)患者116例，其中男77例，女39例，年龄37～83岁，平均年龄(65.34±10.87)岁，85例确诊为CAD(T2DM合并CAD组)，31例为单纯T2DM患者(单纯T2DM组)。排除标准：(1)1型糖尿病、妊娠期糖尿病、继发性糖尿病、糖尿病急性并发症；(2)合并先天性心脏病、心肌炎、急/慢性感染、心肌梗死、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤；(3)曾接受静脉溶栓、介入治疗、搭桥手术。选取同期因胸痛行CAG及常规检查结果均正常，且糖耐量试验正常者30例作为对照组，其中男19例，女11例，年龄34～82岁，平均年龄为(66.78±12.03)岁。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有受试者均签署知情同意书。

2.方法

(1)CAG：由两位副主任医师以上级别的介入专家根据Judkin’s法依次进行右侧和左侧冠脉造影，采用CRSPC图像处理系统定量分析冠状动脉病变支数和狭窄程度。Gensini评分为0～30分为冠脉轻度病变，31～60分为冠脉中度病变，>60分为冠脉重度病变。

(2)血液样本采集及常规实验室检查：3组受试者均于入院次日清晨采集空腹外周静脉血5 ml，37 ℃静置30 min，1 000 r/min离心5 min，离心半径为10 cm，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存用于提取血清总RNA。同时采集外周静脉血3 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，2 h内送检生化指标，包括甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等。同时3组受试者均行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。

(3)血清miR-30a水平检测：采用Trizol试剂提取血清总RNA。采用凝胶电泳和分光光度法检测RNA纯度和浓度。取1 μg RNA，加入逆转录茎环引物和M-MLV逆转录酶进行逆转录反应。将cDNA保存于-20 ℃冰箱备用。按照3步法进行实时定量聚合酶链反应。以组织cDNA为模板，小分子U6为内参，加入TaqDNA聚合酶、引物、SYBR Green I Msater配制20 μl反应体系，95 ℃ 30 s预变性，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，循环42次，72 ℃延伸30 s。miR-30a引物序列：上游引物：5’-TGG CCT TGT ACC GAT TGC TG-3’；下游引物：5’-GCT GCT CTT CCT TTC CTG TGT TC-3’)；U6引物：上游引物：5’-AAC TGT GCC AAC CAG TCC AA-3’；下游引物：5’-TCT TCT CAA ATG CCC TTT CAT CA-3’)。收集荧光信号，以2-ΔΔCt表示miR-30a相对表达水平。

(4)血清YKL-40水平检测：采用人酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)检测血清YKL-40水平。

(5)双荧光素酶报告基因检测miR-30a和YKL-40的靶向关系：通过在线生物学信息数据库(www.microrna.org)预测miR-30a的靶基因，采用XbaI和FseI(10 U/μl)对pGL3.0荧光素酶报告载体进行双酶切，在T4 DNA连接酶作用下，将设计好的miR-30a mimics序列连接至pGL3.0载体上，并进行扩增。利用基因突变技术将结合位点序列进行突变，构建YKL-40突变质粒。用YKL-40野生质粒、突变质粒分别与miR-30a mimics共转染细胞，后续操作按照试剂盒说明书进行，采用Promega GloMaxTM20/20发光检测仪检测荧光素酶活性。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Sigma公司。

结 果

1.3组受试者一般资料和临床资料比较:3组受试者性别、年龄、BMI、吸烟史、血脂、血压比较差异均无统计学意义(P>0.05)。3组受试者空腹血糖(FPG)、OGTT 2 h血糖(2h PG)、糖化血红蛋白(HbAlc)、血清miR-30及YKL-40水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中单纯T2DM组和T2DM合并CAD组患者FPG、2h PG、HbAlc及血清YKL-40水平均高于对照组，血清miR-30a水平低于对照组(P<0.05)；且T2DM合并CAD组患者血清miR-30a水平低于单纯T2DM组，血清YKL-40水平高于单纯T2DM组(P<0.05)。见表1。

表1 3组受试者一般资料和临床资料比较

2.双荧光素酶报告基因检测结果:图1显示的是miR-30a序列与YKL-40的互补结构域。将野生型YKL-40 3’-UTR的基因报告质粒同miR-30a mimics共转染后，荧光酶活性被明显减弱(P<0.05)，其对荧光酶活性的抑制作用达48.62%，而将突变型YKL-40的基因报告质粒与miR-30a mimics共转染后，其未对荧光素酶活性产生明确影响。

图1 miR-30a序列与YKL-40的互补结构域

3.不同冠脉病变程度T2DM合并CAD患者血清miR-30a和YKL-40水平比较:轻、中、重度病变组T2DM合并CAD患者血清miR-30a(0.62±0.23比0.43±0.27比0.35±0.18)比和YKL-40水平[(85.58±29.15)ng/ml比(100.62±32.17)ng/ml比(117.98±41.13)ng/ml]比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其中中、重度病变组患者血清miR-30a水平均低于轻度病变组，血清YKL-40水平高于轻度病变组(P<0.05)；重度病变组患者血清miR-30a水平低于中度病变组，血清YKL-40水平高于中度病变组(P<0.05)。

4.血清miR-30a和YKL-40水平的相关性分析：Pearson相关分析结果显示，在单纯T2DM患者和T2DM合并CAD患者中，血清miR-30a与YKL-40水平均呈负相关(r=-0.365、-0.589，P均<0.001)，而在对照组受试者中，血清miR-30a和YKL-40水平无相关性(r=-0.075，P=0.673)。

5.血清miR-30a和YKL-40诊断T2DM患者合并CAD的价值：ROC曲线分析结果显示，血清miR-30a及miR-30a联合YKL-40的ROC曲线下面积(AUC)均>0.7(P<0.05)，其诊断价值相对较高。见图2和表2。

表2 血清miR-30a和YKL-40诊断T2DM患者合并CAD的ROC曲线分析结果

图2 血清miR-30a和YKL-40诊断T2DM患者合并CAD的ROC曲线

讨 论

YKL-40由中性粒细胞、巨噬细胞等合成[5]。王昌敏等[6]证实血清YKL-40在急性冠脉综合征患者中的表达水平明显升高，且与高敏C反应蛋白(hs-CRP)、P选择素水平呈正相关。钱琦等[7]也发现CAD患者血清YKL-40水平高于健康人群。表明YKL-40可能参与动脉粥样硬化的发生发展，且可能反映冠脉病变的严重程度。本研究中，单纯T2DM组和T2DM合并CAD组患者血清YKL-40水平均高于对照组，T2DM合并CAD组患者血清YKL-40水平高于单纯T2DM组，且随着冠脉病变程度的加重，血清YKL-40水平逐渐升高，表明糖尿病患者本身就存在慢性炎症反应，且随着冠心病的进展，炎症反应逐渐加重。

miR-30a在心肌细胞和血管内皮细胞中高表达。Huang等[8]研究结果显示，miR-30a可能通过调控下游炎症因子，影响血管内皮细胞增殖、迁移、粘附等过程。本研究中，我们首先通过在线生物学数据库信息推断YKL-40可能是miR-30a的下游靶基因，二者具有互补结合序列，通过双荧光素酶报告基因检测结果进一步从分子水平证实miR-30a和YKL-40之间的靶向关系。因此，我们推测miR-30a可联合YKL-40用于量化冠脉病变的进程。本研究中，单纯T2DM组和T2DM合并CAD组患者血清miR-30a水平均低于对照组，T2DM合并CAD组患者血清YKL-40水平低于单纯T2DM组，且随着冠脉病变程度的加重，血清YKL-40水平逐渐降低；Pearson相关分析结果显示，在单纯T2DM患者和T2DM合并CAD患者中血清miR-30a与YKL-40水平均呈负相关；ROC曲线分析结果显示，血清miR-30a及miR-30a联合YKL-40诊断T2DM患者合并CAD的价值相对较高，因此，我们推测miR-30a和YKL-40相互作用、共同参与冠脉粥样硬化过程。

综上所述，miR-30a及其下游靶分子YKL-40不仅参与T2DM和CAD血管炎症反应过程，而且与其冠脉病变程度密切相关。血清miR-30a水平降低和YKL-40水平升高可在一定程度上预警T2DM患者发生心血管并发症，且有望成为诊断T2DM合并CAD的指标之一，对于T2DM患者合并CAD的预防有一定的指示作用。