没食子酸对D-半乳糖致雄性小鼠肝脏损伤的保护作用

翟晓瑞,霍明洋,周 旋,马一芯,史海燕,马洪波,郗艳丽

(吉林医药学院公共卫生学院,吉林吉林132013)

D-半乳糖目前被广泛用于衰老、脑老化、肝损伤、糖尿病性视网膜病等疾病的模型复制[1]。D-半乳糖可特异性地作用于肝脏半乳糖代谢途径，使肝细胞功能蛋白和膜蛋白合成受阻，从而造成细胞膜破裂，肝脏特异性酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)释放，肝细胞坏死[2-4]。D-半乳糖能损伤细胞器，耗竭磷酸尿苷，使依赖其生物合成的核糖蛋白、脂蛋白减少，限制细胞器及酶的生成和补充，使细胞器受损。D-半乳糖能产生氧化应激反应产生氧自由基，脂质过氧化反应加剧，活性氧水平上升，还原性保护酶GSH-Px、SOD、CAT等活性下降，过氧化物通过相应的信号转导途径诱导肝细胞凋亡，使肝细胞的损伤进一步加剧[1]。D-半乳糖常用来构建肝损伤实验动物模型，进而研究治疗肝组织损伤的药物或探讨作用机理。

没食子酸(Gallic acid)广泛存在于五倍花、茶叶、葡萄、刺云实豆荚等植物中[5-6]，具有多种生物活性，没食子酸不良反应小，能通过结合自由基而清除自由基，故而显示出抗氧化性[7]，这表明了没食子酸在拮抗D-半乳糖引起的肝损伤方面可能有一定的作用。本试验利用D-半乳糖构建肝损伤小鼠模型，给予没食子酸，观察其对肝组织损伤的影响。

图1 各组小鼠肝组织切片图(H.E.染色，200×)
Fig.1 liver section of mice in each group(H.E. staining, 200 ×)
a:对照组； b:模型组； c:阳性对照组; d:没食子酸低剂量组； e:没食子酸中剂量组； f:没食子酸高剂量组
a: Control group; b: Model group; c: Positive control group; d: Low-dose gallic acid group;
e: Medium-dose gallic acid group; f: High-dose gallic acid group

1 材料与方法

1.1 动物 60只SPF级健康ICR雄性小鼠，体质量18～22 g，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)-2016-0003，饲养于吉林医药学院实验动物中心，合格证号：SYXK(吉)2012-0004，温度18～22 ℃，相对湿度45%～65%，明暗交替。普通饲料喂养，自由饮水。普通饲料购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)-2015-0005。

1.2 试剂与仪器 Synergy H1M酶标仪(美国BioTek)，BS224S-CW电子分析天平(德国赛多利斯科技仪器)，NIU普通光学显微镜(日本尼康)。过氧化氢(Hydrogen Peroxide，H2O2)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，D-半乳糖(上海生物工程有限公司)，维生素E[生工生物工程(上海)股份有限公司]，没食子酸(美国Sigma)，SYBR Green qPCR Mix和BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，逆转录试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司)。

1.3 动物分组与模型构建 60只小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、没食子酸低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，正常饮水摄食。空白对照组皮下注射生理盐水15 mL/(kg·bw·d)，其余各组给予颈部皮下注射D-半乳糖120 mg/(kg·bw·d)构建损伤模型，连续注射42 d，模型组和空白对照组各随机选取3只小鼠，断尾取血，测定MDA含量，若模型组小鼠血液中MDA含量明显高于空白对照组，表明造模成功。从第43天开始，以没食子酸为抗损伤药物进行干预，空白对照组和模型组灌胃生理盐水15 mL/(kg·bw·d)，阳性对照组灌胃维生素E 60 mg/(kg·bw·d)，没食子酸低、中和高剂量组分别灌胃50、100 mg/(kg·bw·d)和200 mg/(kg·bw·d)没食子酸，连续灌胃30 d[8]。

1.4 样品采集及检测 摘取小鼠肝脏并用生理盐水洗去血污，滤纸蘸干水分后精确称重。按公式[肝体比(%)=脏器质量/体质量×100%]计算肝体比。切取相同部位的小鼠肝组织，按1∶9(W/V)的比例加入生理盐水进行匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，按照试剂盒说明书的方法检测肝组织中的SOD、MDA、GSH-Px、T-AOC、CAT和H2O2水平。剩余肝组织冻于液氮中，用于后续检测。

1.5 肝脏的病理学观察 切取相同部位的小鼠肝脏组织，固定于4%多聚甲醛溶液，梯度精酒脱水，石蜡包埋，制作切片，苏木精-伊红(H.E.)染色，光镜下观察肝脏病理改变并拍照。

1.6Nrf2和HO-1 mRNA水平的检测 切取30～50 mg肝组织，TRIzol法提取RNA[9]，通过反转录试剂盒获得肝组织基因组cDNA[10]，并以此为模板，采用qPCR法检测相关基因mRNA的表达水平[11]。在检测过程中，以GAPDH作为内参照，并将基因在空白对照组的表达水平设为“1”，通过等比例比较基因在各剂量组中的表达水平。qPCR法所用引物序列：Nrf2上游引物为5′-CCCAGCAGGACATGGATTTGA-3′，下游引物为5′-AGCTCATAGTCCTTCTGTCGC-3′；HO-1上游引物为5′-CGACAGCATGTCCCAGGATT-3′，下游引物为5′-TCGCTCTATCTCCTCTTCCAGG-3′；GAPDH上游引物为5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′。

1.7 统计分析 试验数据结果均采用SPSS 16.0软件进行分析，结果以平均值±标准差表示，多组计量资料采用方差分析(ANOVA)中的LSD法进行样本之间的两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各剂量组肝体比的变化 给予D-半乳糖、维生素E和没食子酸后，各组小鼠摄食和饮水均正常，尿量正常，小鼠被毛顺滑有光泽，精神活泼，对外界反应灵敏，姿态和步态均无异常。试验结束时，各剂量组终末体质量、肝脏质量和肝体比的变化均无明显差异(P>0.05)(见表1)。

2.2 各剂量组SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT、MDA和H2O2含量变化 由表2可知，与空白对照组比较，模型组小鼠肝组织SOD、GSH-Px、T-AOC和CAT含量显著降低，MDA和H2O2含量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，阳性对照组小鼠肝组织SOD、GSH-Px和CAT含量显著升高，MDA和H2O2含量显著降低(P<0.05)；没食子酸低剂量组小鼠肝组织GSH-Px和T-AOC含量显著升高，MDA和H2O2含量显著降低(P<0.05)；没食子酸中、高剂量组小鼠肝组织SOD、GSH-Px、T-AOC和CAT含量显著升高，MDA和H2O2含量显著降低(P<0.05)。与没食子酸低剂量组比较，没食子酸中剂量组小鼠肝组织SOD含量显著升高(P<0.05)；没食子酸高剂量组肝组织SOD、GSH-Px、T-AOC和CAT含量显著升高，MDA和H2O2含量显著降低(P<0.05)。与没食子酸中剂量组比较，没食子酸高剂量组肝组织GSH-Px和T-AOC含量显著升高，MDA和H2O2含量显著降低(P<0.05)。与阳性对照组比较，没食子酸高剂量组SOD、T-AOC和T-AOC含量均略高于阳性对照组(P<0.05)，MDA和H2O2含量均显著低于阳性对照组(P<0.05)。

表1 没食子酸对D-半乳糖诱导的肝损伤小鼠肝体比的影响Table 1 Effect of gallic acid on hepatosmatic index of liver injury induced by D-galactose in mice

表2 没食子酸对D-半乳糖诱导的肝损伤小鼠SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT、MDA和H2O2含量的影响Table 2 Effect of gallic acid on SOD, GSH-Px, T-AOC, CAT, MDA and H2O2 activities of liver injury induced by D-galactose in mice (n=10，U/mg)

2.3 各组小鼠肝脏组织病理学变化 由封三彩版图1可知，空白对照组肝细胞周围无炎症细胞浸润，肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，且排列整齐，肝小叶的轮廓清晰，细胞分界清楚，细胞核位于细胞中央，细胞质丰富。模型组可见肝细胞呈现气球样变性，细胞胞体增大，胞浆清亮呈空泡状，且数量较多，小叶内炎性细胞浸润明显。给予没食子酸后，肝细胞气球样变性显著得到改善，细胞水肿得到改善。随着没食子酸给药剂量的增加，肝细胞气球样变性改善的越显著，肝细胞中未见肝细胞坏死，肝小叶内炎性细胞浸润减少，呈少量散在。阳性对照组改变类似没食子酸组。

2.4 各组小鼠肝组织Nrf2和HO-1 mRNA的表达水平 由图2可知，模型组的Nrf2和HO-1 mRNA水平高于空白对照组，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。阳性对照组的Nrf2 mRNA水平显著高于空白对照组和模型组(P<0.05)，HO-1的mRNA水平虽高于空白对照组和模型组，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。没食子酸低和中剂量组Nrf2和HO-1 mRNA水平虽高于模型组，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，没食子酸高剂量组HO-1 mRNA水平显著高于空白对照组、模型组、阳性对照组、没食子酸低和中剂量组(P<0.05)，没食子酸高剂量组Nrf2 mRNA水平虽高于模型组、没食子酸低和中剂量组，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

在国内，通常利用D-半乳糖诱导的肝损伤检验药物对肝脏的保护作用[12-14]。本试验采用大剂量D-半乳糖颈部皮下注射的方法，成功制作了亚急性损伤小鼠模型，通过对氧化损伤特异性指标MDA的检测，确定构建的模型准确可靠。通过试验发现，模型组MDA含量显著高于空白对照组，表明D-半乳糖能够引起受试动物出现氧化损伤，而这种氧化损伤正是机体细胞衰老的重要机制之一。试验过程中还发现，各剂量组受试动物体质量稳步上升，这表明给予的受试药物对动物体质量未产生显著影响。维生素E是细胞外液主要的抗氧化剂，发挥抗氧化、抗衰老的作用。本试验在制作亚急性损伤模型的同时，利用大量维生素E治疗D-半乳糖引起的损伤，以维生素E作为阳性药物，进一步考察没食子酸对D-半乳糖诱导肝脏损伤的保护作用。

图2 各组小鼠肝组织Nrf2和HO-1mRNA表达水平
Fig.2 Expression level ofNrf2 andHO-1mRNA inliver tissue of mice in each group

SOD能清除机体产生的超氧阴离子，防止超氧离子的氧化作用[15]。MDA是自由基不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化作用的产物，能与膜蛋白或磷脂的游离氨基交联，使膜的结构破坏，功能减退，最终导致细胞衰亡，其含量的多少反应组织细胞的脂质过氧化速率或强度，故MDA含量可直接反映机体的损伤程度[16]。本试验的结果表明，D-半乳糖诱导的损伤模型小鼠肝组织细胞的SOD含量显著低于空白对照组，MDA含量显著升高。没食子酸能显著升高肝细胞的SOD含量，降低MDA含量，且具有较好的量效关系。

内源性抗氧化酶T-AOC、GSH-Px和CAT是组织抗氧化应激的敏感指标，作为机体重要的抗氧化系统，这些内源性的酶决定了机体对抗氧化损伤的能力。因此在D-半乳糖诱导肝组织损伤的过程中，通过检测T-AOC、GSH-Px和CAT含量可以反映机体肝组织损伤的程度。本试验结果显示，模型组肝组织T-AOC、GSH-Px和CAT含量显著低于空白对照组，没食子酸治疗后，T-AOC、GSH-Px和CAT含量显著升高。CAT是能够使H2O2分解为分子氧和水的一种酶，从而使机体免受H2O2的损害。本试验结果显示，模型组CAT含量降低的同时，H2O2含量显著升高。给予没食子酸后，H2O2含量显著降低。

肝脏组织病理检测结果显示，模型组肝组织出现了气球样变性，D-半乳糖成功诱导肝组织出现损伤。给予没食子酸后，肝组织的病理改变得到显著改善，表明没食子酸能有效改善D-半乳糖引起的肝组织损伤。

Nrf2信号通路时集体细胞最重要的抗氧化防御机制之一。此信号通路的上调可诱导多种抗氧化酶及解毒酶，加速酶促反应，提高SOD等抗氧化物质的表达水平，清除自由基，维持细胞内的氧化还原状态，进而发挥保护细胞的作用。HO-1是非常重要的Ⅱ相解毒酶，其诱导表达是细胞氧化应激时的重要保护机制之一。HO-1的保护作用与其能减轻脂质过氧化反应有关。本试验发现，D-半乳糖干预后，升高了Nrf2和HO-1的mRNA水平，给予没食子酸治疗后，Nrf2和HO-1的mRNA水平升高显著[17]。这一结果表明，没食子酸能提高机体的抗氧化能力，进而发挥保护机体的作用。

综上，利用D-半乳糖成功诱导肝组织氧化损伤，导致MDA含量升高，SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶含量降低，Nrf2和HO-1的mRNA水平升高。给予没食子酸后能有效改善这种损伤，起到保护肝组织的作用。