复方增免散对雏鸡传染性法氏囊病疫苗免疫效果的影响

孟志敏,黄占欣,赵 达,魏淑玲

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院,河北邯郸056000 ； 2.河北省石家庄市藁城区畜牧工作总站 ，河北石家庄052160； 3.河北省农业广播电视学校石家庄市鹿泉区分校,河北石家庄050200)

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的幼鸡的一种急性高度接触性传染病[1]。幼鸡感染后，可导致严重的、长期的免疫抑制，并可诱发多种疾病或使多种疫苗免疫失败，因此常造成巨大的经济损失[2-3]。在临床中鸡群接种鸡传染性法氏囊病疫苗后，有时还会出现鸡传染性法氏囊病病例，其主要原因是疫苗保护率低和某些免疫抑制因素。本试验旨在研究增免散对鸡免疫功能的调节作用，为兽医临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄海兰褐蛋公鸡200只，购自邢台市昌盛种鸡孵化场。

1.2 药品与试剂 法氏囊病病毒抗体ELISA检测试剂盒，购自上海一研生物科技有限公司；鸡IL-2、TNF-α ELISA检测试剂盒，均购自北京百奥莱博科技有限公司；鸡传染性法氏囊病毒弱毒疫苗，为瑞谱(保定)生物技术公司产品。

1.3 主要仪器设备 电子天平，上海浦春计量仪器有限公司生产；酶标仪，上海三科仪器有限公司生产。

1.4 增免散组方与制备 增免散方剂组成如下：紫锥菊500 g，黄芪500 g，当归300 g，石菖蒲200 g，甘草100 g，以上药材购自石家庄乐仁堂大药房，经鉴定符合药典规范的道地中药材。按上述比例粉成粗粉过筛，混匀装袋，即得。

1.5 试验动物分组 1日龄海兰褐蛋鸡正常饲养至6日龄，选体重、发育及健康状况接近的200只，随机等分为A，B，C，D四个大组，每组50 只。其中增免散分为3个剂量组：A 组为低剂量组(0.5 %)，B 组为中剂量组(1 %)，C 组为高剂量组(1.5 %)，D 组为对照组，对照组为正常免疫不用药组。6 日龄雏鸡开始饲喂添加药物的饲料，连续7 d。自由饮水，常规饲养管理。13日龄进行法氏囊弱毒苗接种免疫，2倍剂量滴鼻点眼。

1.6 免疫器官指数的测定 在21、28、35日龄和42日龄，每组随机取5只鸡剖取法氏囊、脾脏，应用电子天平称重，并与相应的体重进行比较，计算脾脏指数、法氏囊指数。

计算公式：脾脏指数=脾脏重(mg)/体重(g)；法氏囊指数=法氏囊重(mg)/体重(g)

1.7 ELISA测定外周血中IBDV抗体 在20、27日龄和34 日龄，每组随机取10 只鸡，翅静脉采血，3 000 r/min离心15 min，吸取血清检测IBDV 抗体。按照试剂盒说明书操作，试剂盒反应终止后，在酶标仪450 nm波长处读取吸光度(Optical density,OD)值，利用已知浓度的标准样品OD值绘制标准曲线，计算各组外周血中IBDV抗体效价。

1.8 ELISA测定外周血中细胞因子IL-2、TNF-α的含量 在20、27日龄和34日龄根据抗原抗体特异性结合的性质，选用种属特异性的酶联免疫分析试剂盒(IL-2、TNF-α)测定血清中的细胞因子的含量。按照试剂盒说明书操作，试剂盒反应终止后，酶标仪读取吸光度OD值，利用己知浓度的标准样品OD值绘制标准曲线，据此标准曲线计算各细胞因子含量。

2 结果

2.1 免疫器官指数测定 不同日龄，各用药组脾脏指数均显著高于对照组，说明增免散能促进脾脏的成长发育。表1中各用药组分别和对照组差异比较，在21、28日龄和42日龄极显著高于对照组(P<0.01)，在35日龄时差异不显著(P>0.05)。

表1 不同日龄不同剂量脾脏指数比较

表2表明，所有用药组法氏囊指数均显著高于对照组，说明增免散能促进法氏囊的成长发育。在21日龄、28日龄、35日龄、42日龄，各用药组法氏囊指数均极显著高于对照组(P<0.01)，以B组中剂量组最为明显。

表2 不同日龄不同剂量法氏囊指数比较

2.2 外周血中IBDV抗体测定 由表3可以看出，由于13 日龄免疫鸡传染性法氏囊病弱毒苗，在肉鸡体内存在的仍然是母源抗体，所以同对照组相比，不同剂量组之间的抗体水平没有差异。20 日龄时饲喂药物的3个剂量组产生的抗体均明显高于对照组D(P<0.01)；中、高剂量组B、C 组抗体显著高于低剂量组A(P<0.01)。中、高剂量组间没有差异；在27 日龄和34 日龄，用药剂量组产生的抗体均明显高于对照组(P<0.01)，而且中、高剂量组同样显著高于低剂量组，中、高剂量组间没有差异。在34 日龄时用药组同样显著高于对照组(P<0.01)，而中、高剂量组同样显著高于低剂量组(P<0.01)。

表3 不同日龄不同剂量各组IBDV抗体滴度(log10)比较Table 3 Comparison of IBDV anitibody titer of different ages and doses

2.3 外周血中细胞因子IL-2、TNF-α的含量测定结果 由表4可知，用药组外周血中IL-2的含量都明显高于对照组，其中B组中剂量组含量最高，持续的时间最久，在免疫后4周内IL-2的含量一直显著高于对照组(P<0.01)，并且持续时间要长于其余各组。

表4 不同日龄不同剂量各组产生IL-2比较Table 4 Comparison of IL-2 generate in groups of different ages and doses (pg/mL)

表5表明，用药组外周血中TNF-α的含量极显著高于对照组(P<0.01)。在21日龄，B组TNF-α含量最高，各组之间差异极显著(P<0.01)；在28日龄，3个用药组之间差异不显著(P>0.05)；在35日龄、42日龄，仍然是B组TNF-α含量最高，各组之间差异极显著(P<0.01)。

表5 不同日龄不同剂量各组产生TNF-α比较Table 5 Comparison of TNF-α generatea in groups of different ages and doses (pg/mL)

3 讨论

法氏囊是禽类重要的中枢免疫器官，是诱导淋巴干细胞成为免疫活性细胞，并将其输送给外周免疫器官的场所。来自于骨髓的多功能干细胞，经血流进法氏囊后分化成为细胞，经淋巴和血液循环移至外周免疫器官的非胸腺依赖区并继续增殖，参与体液免疫。如雏鸡法氏囊发育良好，则有利于抗体水平的提高[4]。脾脏是体内最大的免疫器官，是产生抗体的主要基地。在本次试验中，从免疫器官指数测定结果可以看出，各用药阶段脾脏指数、法氏囊指数均明显高于对照组，说明各加药组均能促进脾脏和法氏囊的成长发育，且中剂量组(B组)作用最显著，时间最持久。各用药组在使用药物后第2周开始表现出药效，A组在用药2周后，也表现出对脾脏和法氏囊发育的促进作用，但是持续作用时间不长，可能是剂量太小的原因。

IBDV主要以B淋巴细胞为靶细胞，引起法氏囊B 淋巴细胞的凋亡，被认为是造成免疫抑制的主要原因[5]。IBDV主要感染未成熟的淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞，由于法氏囊是淋巴细胞成熟的重要器官，鸡在感染后，淋巴滤泡内的淋巴细胞大量裂解死亡，网状细胞呈凋亡过程，最终导致法氏囊等器官萎缩，或是淋巴细胞功能降低持续时间较长，同时血清、泪液、气管液、胆汁、肠液中IgM、IgG、IgA含量明显下降，从而引起免疫抑制，同时对淋巴细胞也有一定损伤作用[2,6]。在本次抗体检测试验研究中，应用增免散后，各用药组的抗体水平有明显的提高，特别是B组，说明B组在剂量上已经达到了最佳的药物效果。试验表明，增免散有明显提高针对IBDV抗体水平，其作用效果可能是增免散中的某种成分保护了法氏囊中的淋巴细胞，免受病毒的影响。国外有研究表明，紫锥菊提取物能够提

高禽类特异性抗体水平，也能提高正常小鼠和免疫抑制小鼠对绵羊血红细胞的抗体水平[7-8]，这与本试验结果相一致。

T淋巴细胞及其所分泌的IL-2在机体特异性免疫应答中起核心作用[9]。IL-2分泌水平高低可以反映机体的免疫机能，特别是细胞免疫水平。TNF是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子。TNF-α主要由巨嗜细胞产生，可介导白细胞积聚与炎症部位，激活炎性白细胞，杀死微生物刺激单核细胞及其他种类细胞产生细胞因子增强免疫反应，杀死或抑制某些肿瘤细胞。从本试验中，从21日龄开始，用药组外周血中IL-2、TNF-α的含量显著高于对照组，提示增免散能显著提高机体细胞免疫水平。

综上所述，增免散对IBDV疫苗的免疫效果有显著促进作用，是一种良好的免疫增强剂。其增强免疫效果途径是从体液免疫和细胞免疫两方面产生作用，对特异性抗原抗体有促进作用，对非特异性的细胞免疫也有促进作用，且以中剂量组(1 %)效果最佳，为临床上防控传染性法氏囊病提供新的思路与方法。