复方山楂煎剂对心肌缺血模型大鼠心肌Caspase-1表达的影响※

李 月,李 想

(1.辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳110032;2.中国医科大学肿瘤医院/辽宁省肿瘤医院,辽宁 沈阳110042)

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少,引起心肌能量代谢不正常的一种病理状态。流行病学研究显示,与动脉粥样硬化相关的重要危险因素为高脂血症、高血压等[1]。冠状动脉粥样硬化是指冠状动脉壁上沉积了一层脂类,从而使冠状动脉弹性降低、管腔变窄。其中氧化修饰的低密度脂蛋白是动脉粥样硬化形成的关键环节,因此降低血脂、预防高脂血症在防治动脉粥样硬化形成中起着重要作用[2]。复方山楂煎剂是由山楂、延胡索、丹参、菊花、红花、麦芽组成,本研究主要观察复方山楂煎剂对心肌缺血模型大鼠心肌Caspase-1表达的影响,现报道如下。

1 研究材料

1.1 实验动物 选取SPF级SD大鼠90只,雌雄各半,体质量180～220 g,购于辽宁长生生物有限公司,合格证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2 药品和试剂 复方山楂煎剂由辽宁中医药大学药物制剂教研室提供;脂必妥片(成都地奥九泓制药厂,生产批号：20170914);丙基硫氧嘧啶(上海复星朝辉药业有限公司,生产批号：20161208);猪油,市售;胆固醇(上海如吉生物科技发展公司,生产批号：20170622);胆酸钠(中国医药上海化学试剂公司,生产批号：F20170428)。丙二醛(MDA)试剂盒(生产批号：20170213B),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(生产批号：20170422),肌酸激酶(CK)试剂盒(生产批号：20170331),以上试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。维生素D3(青岛双鲜药业有限公司),半胱天冬酶-1(Caspase-1)抗体(北京博奥森生物技术有限公司),PBS磷酸缓冲盐(北京索莱宝科技有限公司),TMS-P超敏试剂盒(福建迈新生物技术开发有限公司),DAB显色剂(福建迈新生物技术开发有限公司)。

1.3 实验仪器 徕卡RM2235型切片机(德国);Be LDHmanCX-7型全自动生化分析仪(美国);岛津U-3010型紫外可见分光光度计(日本);BK-P型生物组织摊片机(山东博科生物产业有限公司);DB-B1型烤片机(北京金时速仪器设备经营部);HWS-100F型恒温恒湿培养箱(上海丙林电子科技有限公司);奥林巴斯BX43型光学显微镜(日本);PHS-3G型PH计(武汉天壹力仪器设备有限公司);JKDP2型电热恒温培养箱(厦门医疗电子仪器厂);JTS-3B型电子秤(厦门懿恒电子有限公司)。

2 方法

2.1 药物制备 按(15∶5∶10∶3.9∶1∶15)比例称取山楂、延胡索、丹参、菊花、红花、麦芽共4 990 g,将以上药物置于不锈钢煎煮锅中,加水10 000 m L,浸泡30 min,煮沸后,文火煎煮30 min,倒出药液,再加水10 000 m L,再次煎煮20 min,合并两次煎液,再浓缩至840 m L。将药液分装7袋,每袋120 m L,4℃保存备用,每日取1袋用于灌胃给药,每周制备1次,中剂量和低剂量药液由高剂量药液按1∶2和1∶4比例稀释所得。

2.2 造模及给药 购入大鼠在实验室适应性饲养1周,随机分成空白对照组、模型对照组、复方山楂煎剂低剂量组(14.85 g生药/kg)、复方山楂煎剂中剂量组(29.7 g生药/kg)、复方山楂煎剂高剂量组(59.4 g生药/kg)、脂必妥组(1.5 g/kg),空白对照组10只,其余各组每组16只,雌雄各半。空白对照组、模型对照组灌胃蒸馏水10 m L/kg,各给药组灌胃相应药物,每日1次,给药体积为10 m L/kg。造模与给药同时进行。空白对照组喂饲普通饲料,其余各组喂饲高脂饲料(胆固醇5%、猪油15%、丙基硫氧嘧啶0.2%、胆酸钠0.2%)[3],同时每2周灌服1次维生素D315万U/kg,实验期间自由摄食、自由饮水,连续造模并给药10周。除空白对照组外,其余各组大鼠于第5周皮下多点注射异丙肾上腺素(1 mg/kg·d-1),隔日1次,共注射3次[4]。

2.3 油红O脂肪染色法及评价方法[5]剪取主动脉瓣骨髓动脉分支处的胸腹主动脉,并纵向剖开,10%甲醛固定,应用油红O脂肪染色法,观察实测动脉内膜脂质斑块的面积,将主动脉内膜动脉粥样硬化的程度分为5级。0级：内膜表面光滑,无红染;1级：内膜有轻度红染,但无突出表面的斑块;2级：有明显凸起红染斑块,面积＜0.5 mm2;3级：0.5 mm2≤斑块面积≤1.5 mm2;4级：斑块融合成片,大部分斑块面积＞1.5 mm2;5级：斑块几乎覆盖整个动脉内膜。

2.4 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水。3%H2O2室温孵育10 min,滴加10%山羊血清封闭,滴加一抗(Caspase-1抗体稀释比例为1∶350)[6],滴加适量的辣根酶标记的链霉素工作液,DAB显色剂显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。免疫组化图片采用Image J软件进行灰度值分析,抗体表达越强,组织染色越深,灰度值越小。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件分析数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验;计数资料以例(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 观察指标 末次灌胃给药1 h后,各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 m L/kg。麻醉后腹主动脉采血,分离血清,检测MDA、GSH-Px、CK含量。取胸腹主动脉,油红O脂肪染色法检测动脉内膜脂质斑块的面积;取心脏左心室,采用免疫组化染色法检测Caspase-1在心肌组织中的表达。

3.2 结果分析

(1)氧化应激指标比较 与空白对照组比较,模型对照组大鼠血清MDA、CK含量升高,GSH-Px含量降低,差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组比较,复方山楂煎剂低剂量组、中剂量组、高剂量组及脂必妥组大鼠血清MDA含量降低,GSH-Px含量升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);复方山楂煎剂中剂量组、高剂量组及脂必妥组大鼠血清CK含量降低,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血液氧化应激指标比较(±s)

表1 各组大鼠血液氧化应激指标比较(±s)

注：与空白对照组比较,△P＜0.05;与模型对照组比较,▲P＜0.05。

组别 只数 MDA(nmol/m L) CK(U/DL) GSH-Px(μ/m L)空白对照组 10 4.68±0.51 402.75±37.21 252.59±27.45模型对照组 16 12.11±1.47△ 665.16±59.16△ 136.18±12.75△复方山楂煎剂低剂量组 16 8.97±0.89▲ 608.47±54.13 180.14±15.31▲复方山楂煎剂中剂量组 16 7.24±0.59▲ 594.86±49.81▲ 196.57±18.84▲复方山楂煎剂高剂量组 16 5.97±0.63▲ 577.94±43.28▲ 225.71±24.41▲脂必妥组 16 9.09±0.97▲ 591.35±62.11▲ 175.34±19.49▲

(2)动脉粥样硬化积分比较 与空白对照组比较,模型对照组大鼠动脉粥样硬化积分升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组比较,复方山楂煎剂中剂量组、高剂量组、脂必妥组大鼠动脉粥样硬化积分降低,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠动脉粥样硬化积分比较(分,±s)

表2 各组大鼠动脉粥样硬化积分比较(分,±s)

注：与空白对照组比较,△P＜0.05;与模型对照组比较,▲P＜0.05。

组别 只数 动脉粥样硬化积分空白对照组 10 0模型对照组 16 2.43±0.81△复方山楂煎剂低剂量组 16 1.80±0.65复方山楂煎剂中剂量组 16 1.41±0.53▲复方山楂煎剂高剂量组 16 1.09±0.34▲脂必妥组 16 1.69±0.62▲

(3)心肌组织中Caspase-1表达比较 与空白对照组比较,模型对照组大鼠心肌组织中Caspase-1表达升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组比较,复方山楂煎剂中剂量组、高剂量组、脂必妥组大鼠心肌组织中Caspase-1表达降低,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中Caspase-1表达比较(±s)

表3 各组大鼠心肌组织中Caspase-1表达比较(±s)

注：与空白对照组比较,△P＜0.05;与模型对照组比较,▲P＜0.05。

组别 只数 Caspase-1空白对照组 10 201.57±19.36模型对照组 16 141.54±12.66△复方山楂煎剂低剂量组 16 153.13±15.18复方山楂煎剂中剂量组 16 168.55±17.48▲复方山楂煎剂高剂量组 16 175.19±21.67▲脂必妥组 16 171.93±19.47▲

4 讨论

临床中可引起心肌缺血的原因较多,其中常见的原因是冠状动脉粥样硬化,在冠状动脉粥样硬化性心脏病的基础上,心肌暂时性缺血会引起血管发生痉挛[7],心肌缺氧使酸性代谢产物刺激感觉神经末梢,诱发心绞痛,冠状动脉粥样硬化性心脏病血管管径狭窄达75%以上,则可发生心肌梗死[8]。本研究采用高脂饮食联合皮下多点注射异丙肾上腺素诱发心肌缺血,既可以观察复方山楂煎剂对高脂饮食引起冠状动脉损伤的影响,又可以观察复方山楂煎剂对心肌损伤模型的影响。缺氧导致心肌产生大量氧自由基,氧自由基作用于细胞膜上的不饱和脂肪酸,使膜脂质发生过氧化反应,进而导致冠状动脉血管损伤,形成脂质过氧化物,MDA是体内重要的氧自由基的代谢产物,能较好地反映组织过氧化程度[9]。MDA是膜脂过氧化作用的产物之一,使细胞膜结构和功能受到损伤,改变膜的通透性,从而影响一系列生理生化反应的正常进行[10]。氧自由基不但可以通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤,还可以通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤[11]。脂质氧化终产物MDA在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性,它的产生可以加剧膜的损伤,因而MDA的含量可反映机体脂质过氧化的程度和细胞损伤的程度[12]。GSH-Px是体内一种重要的过氧化物分解酶,GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸,它可以使有毒的过氧化物还原为无毒的羟基化合物,从而保护细胞膜的结构及功能不受损害。CK也称为肌酸磷酸激酶,以心肌、平滑肌含量为多,CK主要存在于细胞质和线粒体中,与细胞内能量运转、ATP再生、肌肉收缩有直接关系。CK活性测定可以用于心肌疾病的诊断,心肌梗死可引起CK水平病理性升高[13]。本研究通过喂饲高脂饲料10周造模,并给予相应药物治疗,结果显示：与模型对照组比较,复方山楂煎剂组大鼠血清中MDA含量显著降低,GSH-Px活性显著提高,CK含量降低。表明复方山楂煎剂具有抗氧化作用,通过抗氧化减轻氧自由基对心肌细胞的损伤,进而降低损伤的心肌细胞向血液中释放CK。

动脉粥样硬化是指动脉内膜有脂质沉积,平滑肌细胞增生,胶原纤维增多,形成粥糜样坏死病灶,其病理改变是在动脉内膜面形成斑块,有脂质条纹、血栓形成和斑块内出血等继发病变。油红O脂肪染色法能显示组织内的脂肪,油红O为脂溶性染料,在脂肪内能高度溶解,可使组织内三酰甘油等中性脂肪着色。本研究结果显示,模型对照组大鼠动脉粥样硬化积分显著升高,动脉内膜有明显的脂质沉积;与模型对照组比较,复方山楂煎剂组动脉粥样硬化积分有所降低。

心肌梗死是由于心肌持久缺血、缺氧所引起的心肌坏死。心肌梗死组织镜下观察可见心肌纤维呈凝固性坏死,根据梗死时间不同,可有中性粒细胞浸润和肉芽组织生长,大约5周后形成瘢痕组织。Caspases能调节多种生物过程,Caspase-3、9、10具有促凋亡作用,以级联的方式切割胞内蛋白,最终导致细胞凋亡;Caspase-1、5、11具有促炎作用,可以介导特异性细胞因子的成熟,还参与细胞焦亡。细胞焦亡为细胞炎性坏死,其表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,引起细胞内容物释放,激活强烈炎症反应的程序性死亡。与细胞凋亡相比,细胞焦亡发生较快,并伴随大量促炎症因子的释放[14]。Caspase-1与动脉粥样硬化的发生关系密切,炎性细胞在体内高度表达可引起心力衰竭,过度表达还可加重心力衰竭。本研究结果表明,复方山楂煎剂可降低Caspase-1在心肌缺血模型大鼠心肌细胞中的表达,减少炎性因子释放,最终减轻因心肌缺血导致的心肌损害。表明复方山楂煎剂可通过抗氧化应激、调节动脉内膜脂质沉积、抗细胞焦亡等作用产生对心肌的保护作用。