生地当归药队煎剂的表面增强拉曼散射光谱

陈伟炜、林 佳、陈 荣、冯尚源、俞 允、林 多、施 红、黄 浩*

1. 福建中医药大学中西医结合学院,福建 福州 350122 2. 医学光电科学与技术教育部重点实验室(福建师范大学),福建 福州 350007

生地当归药队煎剂的表面增强拉曼散射光谱

陈伟炜1、林 佳2、陈 荣2、冯尚源2、俞 允1、林 多1、施 红1、黄 浩1*

1. 福建中医药大学中西医结合学院,福建 福州 350122 2. 医学光电科学与技术教育部重点实验室(福建师范大学),福建 福州 350007

为揭示单味煎剂与方剂间的关系、分别测试分析了生地当归药队、单味药生地和单味药当归煎剂的表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)光谱、并对其进行谱峰归属。本文主要针对存在于三种煎剂中的17个拉曼信号(538、622、732、761、835、876、959、1 145、1 245、1 276、1 326、1 402、1 456、1 470、1 518、1 546和1 605 cm-1)进行讨论。生地当归药队煎剂SERS光谱在538、732、761、835、876、959、1 145、1 245、1 276、1 326、1 402、1 456、1 470、1 518和1 605 cm-1处、出现15个明显的拉曼信号； 生地煎剂SERS光谱在538、761、835、876、959、1 145、1 245、1 276、1 326、1 402、1 470、1 518和1 546 cm-1处、出现13个明显的拉曼信号； 当归煎剂SERS光谱在538、622、732、761、835、876、959、1 245、1 326和1 402 cm-1处、出现10个明显的拉曼信号。生地当归药队煎剂SERS光谱保留了和未观察到生地和当归单味煎剂的某些拉曼峰、且产生了生地和当归单味煎剂中所没有的拉曼信号(1 456和1 605 cm-1)、即产生新药物成分。生地当归药队煎剂所包含的药物成分并非是生地和当归单味药物煎剂所含药物成分的简单相加。结果表明、SERS光谱可能为方剂研究提供一种高灵敏度、快速准确和操作简单的检测方法。

表面增强拉曼散射(SERS)； 银胶； 生地当归药队煎剂； 生地煎剂； 当归煎剂

引 言

作为一复杂的系统、中药包含了许多自然源成分； 由于实在的临床效果、中药受到了世界范围的关注[1-2]。中药制剂是作为临床治疗常用的一种用药方式； 比如、葛根汤是一剂常用于治疗感冒的汤剂[3]； 鱼腥草超临界萃取物被广泛使用于抗炎症治疗[4]； 大川芎方在临床上广泛用于血瘀型头痛和偏头痛的治疗[5]； 生地当归汤在骨折早期治疗中抗自由基损害取得了一定的临床效果[6]。目前临床使用的方剂基本由数味中药组成、人们极为关注方剂与组成方剂的单味药之间的生化成分关系、因此需要一种高灵敏度和有效的分析技术去探测单味药和方剂的内在成分。

作为一无损的散射分析方法、常规拉曼光谱可探测样品的生化信息、从而在分子水平上去区分不同的样品[7-8]。由于弱拉曼散射和强荧光影响、常规拉曼光谱的应用受到了极大限制、尤其在液体样品的检测[9-10]。为克服常规拉曼光谱的缺点、表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)光谱被应用于检测。在SERS中、拉曼信号的强度可提高至13～15个数量级[11]。SERS已经广泛应用于大分子、细胞、组织和体液的检测[11-15]。特别引起注意的是、该技术可成功提取液体的信号[11,16-18]。所以SERS技术完全适用煎剂的检测。

本文的生地当归药队取自临床效果好的活血化瘀汤方[19]、采用药队协同效应设计法将活血化瘀汤方分为“化瘀生新”、“活血止痛”、“补气”、“调和”四个药队[20]、生地当归药队为补气药队。在本研究中、我们检测了生地当归汤药队煎剂(sheng-di-dang-gui decoction,SDDGD)、生地煎剂(sheng-di decoction,SDD)和当归煎剂(dang-gui decoction,DGD)的SERS光谱、探知各自成分、并揭示单味煎剂与方剂间的关系。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

分析试剂：AgNO3,NaOH,HONH3Cl。生地和当归购自著名医药公司同仁堂。所有的药材都经福建中医药大学专业医师辨识。在整个实验过程都使用超纯水。

1.2 仪器

Renishaw inVia拉曼显微光谱仪(UK) 、PerkinElmer Lambda 950分光光度计(USA)、Millipore Simplicity超纯水系统(USA)。

1.3 三种煎剂和银胶的制备

生地9 g+当归9 g、生地9 g和当归9 g分别与水混合后煮三次(1∶10,w/v)、每次煮1 h、而后将每次的萃取液混合并过滤、最终分别获得0.8 μg·mL-1的生地当归药队煎剂、生地煎剂和当归煎剂[18]。银胶的制备采用Leopold所述法[21]。图1(c)为银胶的紫外/可见吸收光谱、吸收峰位于416 nm。图1的插入图为银胶电镜图、可看出银纳米粒子的平均直径为38 nm。

图1 生地当归药队煎剂(a)、生地当归药队煎剂-银胶系统(b)和银胶(c)的紫外/可见吸收光谱； 插入图为银胶电镜图

Fig.1 (a) UV/Visible absorption spectra of the SDDGD,(b) SDDGD-Ag colloid system,and (c) pure Ag colloid. The inset photograph shows a TEM micrograph of the Ag colloidal surface

1.4 SERS光谱检测

所有的SERS光谱均在雷尼绍拉曼显微光谱系统inVia上进行测量。785 nm半导体激光器作为激发光源、SERS光谱收集范围：500～1 620 cm-1。SERS光谱测量于50倍镜头的显微镜(光谱分辨率为2 cm-1)的条件下。信号最后被Peltier致冷器件进行致冷CCD接收。利用软件包WIRE 2.0(Renishaw)获取和分析光谱。SERS光谱收集时间：10 s。在SERS检测前、生地当归药队、生地和当归煎剂分别和银胶以1∶1比例混合、然后将混合物置于铝片以备SERS分析。在相同的测试条件下检测了生地当归药队煎剂、生地煎剂和当归煎剂的SERS光谱、每种煎剂都取30个样品、每个样品1条谱线。

1.5 数据处理

对每一条SERS谱线扣除荧光背景、并在500～1 620 cm-1波数范围内进行面积归一化处理、从而可以更好地进行光谱线差异性的比较。

2 结果与讨论

2.1 煎剂的拉曼信号增强分析

如图2(b)所示、在生地当归药队煎剂的常规拉曼光谱图上无观察到任何的信号、这是因为生地当归药队煎剂的拉曼信号被液体的强荧光覆盖[11,22]。相反地、如图2(a)所示、在生地当归药队煎剂的SERS光谱上出现了15个信号峰、这说明银纳米粒子和生地当归药队煎剂的生化分子产生强交互作用、此作用导致了煎剂的强拉曼散射效应。

图2 生地当归药队煎剂的SERS光谱(a)； 生地当归药队煎剂的常规拉曼光谱(b)； 银胶的拉曼光谱(c)

Fig.2 (a) The SERS spectrum of the SDDGD with Ag colloid; (b) The conventional Raman spectrum of SDDGD without Ag colloid; (c) The Raman spectrum of Ag colloid

这种强交互作用可由图1(b)的共振吸收峰(815 nm)解释。图1(a)和(c)分别显示了生地当归药队煎剂的260 nm吸收峰和银胶的416 nm吸收峰。从图1(b)可看出、260和416 nm和在长波长区的新峰(815 nm)同时出现在生地当归药队煎剂-银胶系统。此行为可描述为聚集的银纳米粒子的表面等离子体共振、表明生地当归药队煎剂的生化分子已紧密地吸附于银纳米粒子表面、因此最终导致了高质量的SERS光谱[23]。图3(b)和(c)显示了生地煎剂和当归煎剂亦具有类似的增强效应。

2.2 三种煎剂的SERS光谱

如图3所示、我们获得了生地当归药队煎剂、生地煎剂和当归煎剂的SERS光谱。生地当归药队煎剂的SERS光谱上呈现15个信号峰(538、732、761、835、876、959、1 145、1 245、1 276、1 326、1 402、1 456、1 470、1 518和1 605 cm-1)； 生地煎剂的SERS光谱呈现13个信号峰(538、761、835、876、959、1 145、1 245、1 276、1 326、1 402、1 470、1 518和1 546 cm-1)； 当归煎剂的SERS光谱呈现10个信号峰(538、622、732、761、835、876、959、1 245、1 326和1 402 cm-1)。表1给出三种煎剂SERS光谱上所有峰的位置和归属、从而可知三种煎剂的分子基团。

图3 生地当归药队煎剂(a)、生地煎剂(b)和当归煎剂(c)的平均归一化SERS光谱

表1 生地当归药队、生地和当归煎剂平均SERS光谱的峰位置和归属[16-19,24]

为了更好地理解生地当归药队煎剂、生地煎剂和当归煎剂SERS光谱峰位置和强度的差异、图4呈现了三种煎剂SERS光谱的峰强度柱状图。

2.3 三种煎剂的SERS光谱分析

2.3.1 同时出现于三种煎剂光谱的成分

图4 生地当归药队煎剂(a)、生地煎剂(b)和当归煎剂SERS光谱(c)的峰强度柱状图、柱状图上显示各峰强度所对应的值和标准偏差

*p<0.05相对于生地当归药队煎剂)

Fig.4 Histogram displaying the prominent differences of Raman peak intensities with standard deviation for (a) the SERS spectra from SDDGD,(b) SDD and (c) DGD

*p< 0.05 loaded different from SDDGD

538、761、835、876和1 245 cm-1拉曼线的强度在生地当归药队煎剂光谱中最强、说明生地当归药队煎剂由生地煎剂和当归煎剂的成分相加。但959、1326和1 402 cm-1拉曼线的强度却在当归煎剂光谱中最强、生地当归药队煎剂光谱次之、生地煎剂最弱、此说明当归与生地混煎时、当归在959、1 326和1 402 cm-1线处所代表的成分部分与生地的某些成分发生作用、从而使这三成分的强度降低。

2.3.2 同时出现于某一单味煎剂与药队煎剂光谱的成分

从图4可看出、当归煎剂的732 cm-1(烯丙基硫醚的C—S伸缩振动)拉曼线也出现于生地当归药队煎剂光谱中、且强度比煎剂光谱要强好几倍、此说明该成分部分在混煎时与生地的某些成分发生作用、从而强度降低。

2.3.3 出现于某一单味煎剂却消失于药队煎剂光谱的成分

由图4可知、622 cm-1(N-乙基乙酰胺的酰胺Ⅳ振动)拉曼线、出现于当归煎剂光谱中却未在生地当归药队煎剂光谱出现； 1 546 cm-1(吲哚环振动)拉曼线、出现于生地煎剂光谱中却未在生地当归药队煎剂光谱出现。单味煎剂的成分消失于药队煎剂光谱、此可能是因为混煎时此成分与另一单味煎剂的成分发生化学反应、导致该成分的消失。

2.3.4 只出现于药队煎剂的新成分

如图4所示、生地当归药队煎剂光谱在1 456 cm-1(蛋白质的CH2变形振动)和1 605 cm-1(酰胺-Ⅰ)线处出现新拉曼信号、但这两成分未出现于两种单味煎剂光谱中。这是由于在混煎时发生了化学反应从而产生新成分。

3 结 论

研究比较分析了生地当归药队、单味药生地和单味药当归煎剂的SERS光谱、它们呈现的拉曼信号峰个数分别为15、13和10。生地当归药队煎剂保留了某些生地和当归单味药煎剂成分； 生地和当归单味药煎剂的某些成分消失于生地当归药队煎剂中； 在生地当归药队煎剂中、产生新的成分、揭示了单味煎剂与方剂间的关系。结果表明、生地当归药队煎剂所包含的成分绝非是生地和当归单味药煎剂成分的相加、SERS光谱术可用于方剂研究。

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*Corresponding author

Surfaced-Enhanced Raman Scattering Spectroscopic Study on Sheng-Di-Dang-Gui Decoction

CHEN Wei-wei1,LIN Jia2,CHEN Rong2,FENG Shang-yuan2,YU Yun1,LIN Duo1,SHI Hong1、HUANG Hao1*

1. College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China 2. Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine,Ministry of Education and Fujian Provincial Key Laboratory for Photonics Technology,Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China

To reveal the relationship between the single decoction and prescription,the surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy of Sheng-Di-Dang-Gui decoction (SDDGD),Sheng-Di decoction (SDD) and Dang-Gui decoction (DGD) were tested and analyzed. Mainly seventeen Raman signals (538,622,732,761,835,876,959,1 145,1 245,1 276,1 326,1 402,1 456,1 470,1 518,1 546 and 1 605 cm-1) in three decoctions were discussed. The characteristic Raman bands of three decoctions were tentatively assigned. Fifteen obvious Raman bands (538,732,761,835,876,959,1 145,1 245,1 276,1 326,1 402,1 456,1 470,1 518 and 1 605 cm-1) were observed in the SERS spectroscopy of SDDGD,thirteen obvious Raman bands (538,761,835,876,959,1 145,1 245,1 276,1 326,1 402,1 470,1 518 and 1 546 cm-1) were observed in the SERS spectroscopy of SDD,ten obvious Raman bands (538,622,732,761,835,876,959,1 245,1 326 and 1 402 cm-1) were observed in the SERS spectroscopy of DGD. Some Raman bands in SERS spectra of SDD and DGD were retained in the SDDGD,however some Raman bands in two kinds of decoctions never appeared in the SDDGD. And new Raman bands (1 456 and 1 605 cm-1) were generated in the SDDGD,resulted in the fact that new chemical compositions were created. Medical ingredients in the SDDGD were not the simple addition of SDD and DGD. The results showed that the SERS spectroscopy might provide a new kind of novel,effective and simple detecting method for the prescription research.

Surface-enhanced Raman scattering (SERS); Ag colloids; Sheng-Di-Dang-Gui decoction (SDDGD); Sheng-Di decoction (SDD); Dang-Gui decoction (DGD)

Oct. 27,2015; accepted Jan. 10,2016)

2015-10-27、

2016-01-10

国家自然科学基金项目(61405036、61178090)和福建省教育厅科技项目(JA15233)资助

陈伟炜、1985年生、福建中医药大学中西医结合学院讲师 e-mail：wwchen072@163.com *通讯联系人 e-mail: cfjtcm@126.com

R284.1; R289.5

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3963-05