GANT61对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖、凋亡的影响及作用机制△

卢恩敏，卢恩娟，高丽京，裴立静，王庆艳

1唐山市丰润区人民医院儿科，河北 唐山 063000

2唐山市丰润区第二人民医院儿科，河北 唐山 063000

髓母细胞瘤（medulloblastoma，MB）是儿童中最常见的中枢神经系统肿瘤[1]。目前的治疗手段主要是以手术和放化疗结合为主，术后患者生存率低，且多数患者常伴随长期的放化疗不良反应[2-3]。目前尚无针对性的治疗药物，研究MB发病的分子机制，探索可用于MB治疗的分子生物学靶点，实现MB的靶向治疗，对改善患者预后具有重要意义。音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信号通路在胃癌、淋巴癌等多种肿瘤组织中异常激活，与肿瘤的增殖和转移密切相关[4]，GANT61是SHH信号通路特异性的抑制剂[5]。本研究通过向人MB Daoy细胞中加入不同浓度的GANT61，观察其对细胞凋亡标志物胱天蛋白酶3（caspase 3）、细胞周期标志物p21和细胞周期蛋白D1（cyclin D1）及SHH信号通路下游的核转录因子GLI家族锌指蛋白 1（GLI family zinc finger 1，GLI1）和 GLI家族锌指蛋白 2（GLI family zinc finger 2，GLI2）的影响，旨在为临床治疗MB提供新的思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人MB Daoy细胞株购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。GANT61购自美国Abcam公司。相差显微镜购自德国Leica公司，多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司，凝胶成像装置、电泳仪电源、转膜装置均购自上海天能科技有限公司。二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）均购自上海恒斐生物科技有限公司；β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，cyclin D1抗体购自美国CST公司，p21、caspase 3抗体均购自美国Abcam公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料均购自上海碧云天生物技术有限公司。MiniBEST Universal RNA Extraction Kit购自日本TaKaRa公司，TaqMan Small RNA Assays试剂盒购自美国Life公司。

1.2 细胞培养

从液氮罐中取出人MB Daoy细胞后，置于37℃水浴锅中复苏细胞。离心去除冻存液（胎牛血清∶DMSO=9∶1）后接种至含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养液中，于5%CO2、37℃无菌培养箱中培养细胞。每隔1天换1次液。每隔2～3天传代1次。

1.3 实验分组

细胞在正常状态下培养24 h后进行分组，共分为4组。A组：培养液中加入0.1%DMSO；B组：培养液中加入10 μmol/L GANT61 和0.1%DMSO；C组：培养液中加入20 μmol/L GANT61和0.1%DMSO；D组：培养液中加入40 μmol/L GANT61和0.1%DMSO。

1.4 MTT 法检测细胞增殖

分别于4组细胞培养0、24、48 h后，吸出培养基，加入含5 mg/ml MTT的新鲜DMEM培养基100 μl，37℃恒温条件下继续培养4 h，应用酶标仪于570 nm波长处检测各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.5 实时定量PCR检测GLI1mRNA、GLI2mRNA的相对表达量

采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取细胞中的RNA，然后按照TaqMan Small RNA Assays说明书合成cDNA。以cDNA为模板进行实时定量PCR。反应条件：95℃5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。GLI1mRNA上游引物为5'-CAGGGAGGAAAGCAGACTGAC-3'，下游引物为5'-GGCTTGGCTGTGGCTTCA-3'；GLI2mRNA上游引物为5'-CAACCAGAACAAGCAGAGCA-3'，下游引物为5'-ACCTCAGCCTCCTGCTTACA-3'。以β-actin为 内参，采用2-△△Ct法计算GLI1mRNA、GLI2mRNA的相对表达量。△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组。

1.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测cyclin D1、p21、caspase3蛋白的表达情况

加入适量RIPA裂解液裂解细胞，低温离心，取上清液采用BCA试剂盒进行蛋白定量，配制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，电泳至溴酚蓝跑出胶面，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，电化学发光法曝光显影，以β-actin为内参，进行半定量分析。

1.7 流式细胞术检测细胞周期

4组细胞培养72 h后，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞，胰蛋白酶消化，收集细胞制成单细胞悬液，70%乙醇固定6 h，加入l ml PI后于4℃冰箱中染色30 min，上机检测每组样本的DNA含量。应用MuticycleAV分析软件对每组样本的细胞周期进行拟合分析。

1.8 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖情况的比较

培养24 h后，C组和D组细胞的OD值均低于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；培养48 h后，C组和D组细胞的OD值均低于A组，D组细胞的OD值低于B组和C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 培养0、24、48 h后4组细胞增殖情况的比较（±s）

表1 培养0、24、48 h后4组细胞增殖情况的比较（±s）

注：a与A组比较，P＜0.05；b与B组比较，P＜0.05；c与C组比较，P＜0.05

组别A组B组C组0.103±0.014 0.112±0.025 0.103±0.035 0.553±0.039 0.443±0.014 0.352±0.130a 0.761±0.121 0.552±0.121 0.364±0.014a D组OD值0 h 0.113±0.014 24 h 0.235±0.043a 48 h 0.140±0.013a b c

2.2 GLI1mRNA、GLI2mRNA 相对表达量的比较

4组细胞中GLI1mRNA、GLI2mRNA的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。C组和D组细胞中GLI1mRNA和GLI2mRNA的相对表达量均低于A组，D组细胞中GLI1mRNA和GLI2mRNA的相对表达量均低于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 4组细胞中GLI1 mRNA、GLI2 mRNA相对表达量的比较

2.3 cyclin D1、p21、caspase3蛋白表达情况的比较

4组细胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。C组和D组细胞中cyclin D1蛋白表达水平均低于A组和B组，p21、caspase 3蛋白表达水平均高于A组和B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 4组细胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表达水平的比较（±s）

表3 4组细胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表达水平的比较（±s）

注：a与A组比较，P＜0.05；b与B组比较，P＜0.05

组别A组B组C组D组F值P值cyclin D1 0.734±0.232 0.721±0.183 0.442±0.171a b 0.284±0.009a b 16.622 0.000 p21 1.153±0.122 1.022±0.315 1.866±0.231a b 1.865±0.212a b 38.530 0.000 caspase 3 0.975±0.144 0.862±0.233 1.366±0.148a b 1.385±0.234a b 18.941 0.000

2.4 细胞周期分布情况的比较

B组、C组和D组中G0/G1期细胞比例均高于A组，G2/M期细胞比例均低于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；C组和D组中G0/G1期细胞比例均高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表4）

表4 4组细胞中细胞周期分布情况的比较（%，±s）

表4 4组细胞中细胞周期分布情况的比较（%，±s）

注：a与A组比较，P＜0.05；b与B组比较，P＜0.05

组别A组B组C组D组F值P值43.816±5.873 56.653±6.810a 58.355±8.922a b 60.383±7.134a b 10.592 0.000 35.453±2.534 33.342±3.210 30.564±5.376 31.223±6.341 2.291 0.095 20.423±4.223 10.726±4.645a 10.544±1.637a 8.326±2.134a 24.924 0.000 G0/G1期S期G2/M期

3 讨论

MB严重影响着世界儿童的健康，每年死亡人数约达10万，但是具体的发病机制仍不清楚[6]。研究发现，SHH信号通路的上下游出现异常激活均可导致肿瘤的发生发展。SHH信号通路在胃癌中过度激活与胃癌的发展及转移相关，SHH信号通路抑制剂可降低胃癌细胞的侵袭能力[7]。GLI1和GLI2是SHH信号通路下游的核转录因子，发挥关键的转录激活作用，在肿瘤中表达升高并参与肿瘤的发生发展[8]。研究表明，GLI的特异性抑制剂GANT61可抑制胶质母细胞瘤中的SHH信号通路，对胶质母细胞瘤的细胞周期调控和细胞增殖具有重要影响[9]。细胞周期调控及细胞凋亡与肿瘤的发生发展密不可分，细胞周期调控失常可导致肿瘤细胞的增殖能力增强。cyclin D1基因位于人染色体11q13，是细胞周期蛋白家族成员之一。cyclin D1是调控细胞周期的重要蛋白，在正常组织中低表达或不表达，在许多组织的癌变过程中，可检测到cyclin D1的表达上调，它是评价肿瘤发生发展及转移的重要指标。目前认为，cyclin D1是调控G期至S期最关键的细胞周期蛋白，细胞周期抑制蛋白p21可抑制cyclin D1的活性，从而导致细胞周期阻滞[10-11]。细胞凋亡是多基因多阶段严格调控的过程。caspase 3是半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，是细胞凋亡的标志性蛋白，能够反映细胞的凋亡水平。有研究表明，caspase 3可以被cyclin D1、p21、GLI1激活，caspase 3被激活后，可使细胞核及细胞骨架中的重要蛋白酶失活，诱导凋亡小体形成，促进细胞凋亡[12-15]。

本研究结果显示，GANT61可显著抑制人MB Daoy细胞的生长，具有抑制MB细胞增殖的作用。进一步研究发现，GANT61能够抑制SHH信号通路下游的关键靶点GLI1和GLI2mRNA水平。Western blot结果显示，GANT61对细胞周期的关键蛋白cyclin D1有下调作用，对于p21及caspase 3有上调作用，说明GANT61具有阻滞细胞周期和促进细胞凋亡的作用。进一步研究GANT61对MB细胞周期的阻滞作用，结果发现，与单独应用DMSO相比，GANT61可阻滞更多肿瘤细胞于G0/G1期。本研究推测GANT61调控细胞周期和抗肿瘤的机制可能主要是通过抑制GLI1mRNA和GLI2mRNA水平进而影响cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表达来实现。

综上所述，GLI1抑制剂GANT61对MB细胞具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，主要是通过调节GLI1和GLI2的mRNA水平进而影响cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表达来实现。目前的研究结果提示，GANT61有望成为临床治疗MB的新药物。