免疫球蛋白样转录物5在胶质母细胞瘤中的表达及对患者预后的评估价值

刘鑫，李民，高兴春#

1西安医学院，西安 710000

2陕西省人民医院神经外科，西安 710068

胶质母细胞瘤是神经外科最常见原发性颅脑肿瘤，好发于幕上大脑半球各处，呈浸润性生长，在所有胶质瘤中恶性程度最高，常可同时侵犯多个脑叶及深部结构，临床疗效较差，预后不良，70%～80%患者的病程仅3～6个月，病程超过1年的患者不超过10%[1-2]。目前，仅发现遗传因素、环境因素及脑部炎症等因素可促进胶质母细胞瘤发生发展，且这些因素对帮助临床诊疗意义不大，而基于分子水平的相关研究较少[3]。数据显示，近年来，胶质母细胞瘤发病率明显升高，探讨其发病机制，提高其早期诊断率及治疗有效率尤为重要[4]。免疫球蛋白样转录物5（immunoglobulin-like transcript 5，ILT5）基因是ILT家族的重要成员之一，主要表达于单核细胞、淋巴细胞及树突状细胞等免疫细胞表面，与机体免疫密切相关[5]。研究发现，ILT4在非小细胞肺癌和卵巢癌中均呈低表达，通过与其配体结合介导细胞内免疫络氨酸抑制基序的负性调节，从而抑制机体淋巴细胞增殖与活化[6-7]。目前，关于ILT5与胶质母细胞瘤的研究较少，具有一定研究价值。本研究探讨ILT5在胶质母细胞瘤中的表达情况，分析其与患者临床特征的关系及对预后评估的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月至2015年11月在陕西省人民医院神经外科接受手术治疗的胶质母细胞瘤患者。纳入标准：①临床症状、实验室检测、影像学检查及术后病理诊断结果确诊为胶质母细胞瘤；②术前未接受任何其他治疗，生存期＞3个月；③卡氏功能状态（Karnofsky performance status，KPS）评分≥50分；④临床资料及随访资料均完整。排除标准：①继发性胶质母细胞瘤；②胶质母细胞瘤复发；③合并其他恶性肿瘤；④失访或因其他原因死亡。依据纳入和排除标准，本研究共纳入92例胶质母细胞瘤患者，其中男50例，女42例；年龄：＞40岁60例，≤40岁32例；KPS评分为（72.47±4.35）分。同期选取行正常脑组织切除减压术的患者，排除合并脑部及其他部位良恶性肿瘤的患者，本研究共纳入40例行正常脑组织切除减压术的患者，其中男24例，女16例；年龄：＞40岁26例，≤40岁14例；KPS评分为（73.39±4.86）分。两组患者性别、年龄及KPS评分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本制备 取胶质母细胞瘤患者的胶质瘤组织和行正常脑组织切除减压术的患者的正常脑组织，生理盐水洗净血迹及脂肪组织等，分为两部分：一部分保存于RNA保存液中，-80℃冰箱保存；另一部分用石蜡包埋，室温常规保存待检。

1.2.2 实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测ILT5mRNA 的相对表达量将组织从-80℃冰箱取出解冻后弃保存液，缓冲液洗净：研磨组织3 min，按比例加入Trizol液，充分均浆，离心弃沉淀，加氯仿震荡混匀，室温静置10 min，离心留上清，按比例加异戊醇，离心留上清，再加入75%乙醇，真空干燥8 min，提取总RNA。依据试剂盒说明书制备cDNA，反应体系：4 μl缓冲液、4 μl混合酶、2 μl引物、4 μl总RNA液和6 μl DEPC水；反应条件：30 ℃ 8 min，42 ℃ 30 min，72 ℃ 10 min；cDNA制备完成，于-20℃冰箱保存。实时荧光PCR扩增，反应液20 μl，包括1 μl上下游引物、1 μl cDNA、0.5 μl Taq DNA 聚合酶、0.5 μl dNTP、5 μl PCR混合液和7.5 μl DEPC水；扩增条件：95℃先2 min后15 s、60 ℃ 1 min，共40个循环，以GAPDH为内参，2-△△Ct计算ILT5mRNA的相对表达量，其中△Ct=CtILT5-CtGAPDH。ILT5上游引物为5'-GGCTGAGTCTGGGCCCCAGGACCCGCAT-3'，下游引物为5'-ATGCTAGGTAACGTAGCTTACGGTTACC-3'；GAPDH上游引物为5'-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3'，下游引物为5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'。

1.2.3 免疫组化法检测ILT5蛋白的相对表达量石蜡标本切片，0.5 mm左右，60℃烤片待检。二甲苯联合不同浓度乙醇进行脱蜡，微波炉高温修复，将组织置于3%的H2O2中3 min，缓冲液清洗3遍，从而阻断内源性过氧化物酶。加入一抗（稀释浓度为1∶300），4℃冰箱过夜，缓冲液清洗3遍；加入二抗（基本没过组织即可），室温避光孵育30 min，缓冲液清洗3遍。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色10 s左右（具体根据实验期情况而定）、苏木素复染、梯度乙醇脱水、透明、封片。选择视野清晰，染色良好的5个视野进行计数，每个视野分别计数1000个。

结果判定[8]：ILT5蛋白主要在细胞质中表达，本研究用染色指数法进行判定，阳性细胞所占比例评分：未见计0分，阳性细胞所占比例＜10%计1分，阳性细胞所占比例为10%～49%计2分，阳性细胞所占比例为50%～75%计3分，阳性细胞所占比例＞75%计4分；染色强度评分：无显色计0分，淡黄色染色计1分，黄色染色计2分，棕黄色染色3分；将阳性细胞所占比例评分与染色强度评分相乘：＞4分为高表达，≤4分为低表达。

1.3 随访方法

所有胶质瘤组患者均须随访，随访方式主要包括门诊复诊、电话及微信平台等，随访截止2018年11月，共3年，中位随访时间为26个月。详细记录患者复发及生存状况，计算总生存期（overall survival，OS）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用Logrank检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ILT5mRNA相对表达量和ILT5蛋白表达情况的比较

胶质瘤组织中ILT5mRNA的相对表达量明显低于正常脑组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。胶质瘤组织ILT5蛋白表达率低于正常脑组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 胶质瘤组织和正常脑组织中ILT5 mRNA相对表达量和ILT5蛋白表达情况的比较

2.2 不同临床特征胶质母细胞瘤患者ILT5mRNA相对表达量的比较

不同性别胶质母细胞瘤患者ILT5mRNA相对表达量的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同年龄、组织学分级、肿瘤直径和肿瘤部位胶质母细胞瘤患者ILT5mRNA相对表达量的比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征胶质母细胞瘤患者ILT5 mRNA相对表达量的比较（n=92）

2.3 不同临床特征胶质母细胞瘤患者ILT5蛋白表达情况的比较

不同性别、肿瘤部位胶质母细胞瘤患者ILT5蛋白表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同年龄、组织学分级及肿瘤直径胶质母细胞瘤患者ILT5蛋白表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同临床特征胶质母细胞瘤患者ILT5蛋白表达情况的比较（n=92）

2.4 ILT5蛋白与胶质母细胞瘤患者预后的关系

ILT5蛋白低表达患者中位生存时间为20.1个月（95%CI：17.4～22.8个月），短于ILT5蛋白高表达患者的28.1个月（95%CI：25.3～31.0个月），差异有统计学意义（P＜0.05）。ILT5蛋白高表达患者3年生存率44.1%（15/34），高于ILT5蛋白低表达患者的22.4%（13/58），差异有统计学意义（χ2=8.767，P=0.003）。（图 1）

图1 ILT5蛋白高表达（n=34）与ILT5蛋白低表达（n=58）胶质母细胞瘤患者的生存曲线

3 讨论

ILT是近年发现的HLA-1受体家族，通过与相关配体结合可抑制细胞免疫反应[9-10]。目前，研究较多的抑制性ILT主要包括ILT2、ILT3和ILT4，均含有免疫络氨酸抑制基序和IgSF区，与免疫相关性疾病密切相关；近年发现其还可在肿瘤细胞中表达，但具体作用机制尚不清楚[11-13]。ILT3和ILT4均在肺癌中异常表达，高爱琴[14]通过对57例非小细胞肺癌患者和A549/H1975/H460/A427四类非小细胞肺癌细胞株研究发现，ILT3在非小细胞肺癌组织及细胞中均呈阳性表达，可明显降低TIL数量，但与患者性别、年龄、肿瘤类型、分化程度及临床分期等临床特征无关。张义[15]则通过50例胃癌组织、癌旁正常组织和6株胃癌细胞株中ILT2、ILT3及ILT4表达水平进行分析，结果发现，ILT2与胃癌相关性最强，有望成为胃癌诊疗的有效指标，与淋巴细胞HLA-G分子阳性表达密切相关，上述研究提示，ILT在肿瘤发生发展中可能发挥重要作用，但近年缺少ILT与肿瘤相关的研究报道。

本研究通过实时荧光PCR和免疫组化检测发现，胶质瘤组织中ILT5mRNA的相对表达量和ILT5蛋白的表达率均低于正常脑组织，表明ILT5在胶质母细胞瘤中低表达，可能作为抑癌基因参与肿瘤的发生发展过程。随后，本研究分析ILT5与胶质母细胞瘤临床特征的关系发现，不同年龄、WHO分级及肿瘤直径胶质母细胞瘤患者ILT5mRNA的相对表达量和ILT5蛋白表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示年龄越小、组织学分级高（Ⅲ～Ⅳ级）、肿瘤直径越大的胶质母细胞瘤患者，ILT5mRNA的相对表达量越低。随访及Kaplan-Meier法绘制生存曲线图发现，ILT5蛋白低表达患者中位生存期较短，3年总生存率较低，可认为年龄越小、组织学分级越高、肿瘤直径越大的胶质母细胞瘤患者预后越差。本研究分析了ILT5在胶质母细胞瘤中的应用价值，但具体作用机制及诊疗价值尚不清楚，有待后续探讨。

综上所述，ILT5在胶质母细胞瘤中低表达，可能与年龄、WHO分级、肿瘤直径及预后等密切相关，有望成为胶质母细胞瘤诊疗的新靶点。