口腔鳞状细胞癌患者中膜型基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶2的表达水平及临床意义

杨易，苏波，马原军，周顺成

解放军中部战区总医院汉口院区口腔科，武汉 430012

口腔鳞状细胞癌是临床中常见的口腔颌面部恶性肿瘤之一，虽然近年来该病的治疗方法已有了较大的进步，但大部分患者因复发或转移而死亡[1]。侵袭及转移对于恶性肿瘤的发生发展具有重要意义，其中细胞外基质进入血管及淋巴是恶性肿瘤转移的一个重要原因，细胞外基质是细胞间的动态网状结构，包括胶原、蛋白聚糖及糖蛋白等，上述物质可在丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等作用下被降解，其中MMP在恶性肿瘤侵袭和转移中的作用被广泛关注，其在血管形成、伤口愈合、肿瘤浸润等方面均具有重要作用[2-3]。目前发现的MMP类型已超过23种，其中膜型基质金属蛋白酶1（membrane type 1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）及MMP2已被证实与多种恶性肿瘤的侵袭及转移有关[4]。本研究探讨了口腔鳞状细胞癌组织中MT1-MMP、MMP2的表达水平及与患者临床特征和生存情况的关系，旨在为口腔鳞状细胞癌的临床诊治提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年1月至2016年1月于解放军中部战区总医院汉口院区接受根治性手术治疗的口腔癌患者。纳入标准：①经病理检查证实为原发性口腔鳞状细胞癌；②接受根治性手术治疗，且术前均未接受过放疗、化疗或免疫治疗；③神志清醒，智力正常，与医护人员交流无障碍。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并糖尿病、感染、贫血；③合并高血压、心脑血管疾病。依据纳入和排除标准，本研究共纳入83例口腔鳞状细胞癌患者。其中，男49例，女34例；年龄39～74岁，平均（58.39±6.93）岁；病变部位：牙龈15例，舌部31例，颊黏膜28例，腭部6例，其他3例。

1.2 免疫组织化学染色方法

步骤如下：①将手术获得的口腔鳞状细胞癌组织标本置于10%中性福尔马林固定液中，室温固定24 h，常规脱水后以石蜡包埋，将包埋后的组织切成4 μm厚的切片，置于烘箱中，67 ℃烘片2 h，脱蜡，以100%、95%、80%、70%的梯度乙醇进行水化后，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，每次5 min；②将冲洗后的切片置于0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中，微波抗原修复15 min，冷却至室温后，PBS冲洗3次，每次5 min；③除去PBS，采用新配制的3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min；④除去PBS，加入山羊血清，室内孵育20 min以封闭非特异性抗原抗体结合位点；⑤将多余的血清除去后，加入一抗 MMP2 或 MT1-MMP 50 μl，置于湿盒中4℃孵育过夜，次日在室温下复温1 h后以PBS冲洗3次，每次5 min；⑥除去PBS，加入生物素标记的二抗，室温放置15 min，PBS冲洗3次，每次5 min；⑦加入新鲜配置的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB），室温孵育5 min，置于显微镜下观察，显色后以纯净水冲洗，终止染色；⑧苏木素复染细胞核，以1%盐酸乙醇分化，氨水促蓝液返蓝，超纯水冲洗，80%、95%、100%梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察染色结果。以PBS代替一抗作为对照。

1.3 免疫组织化学染色结果判定

以免疫组化半定量分析方法对MT1-MMP、MMP2的表达情况进行判定，以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性。根据染色程度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。依据阳性细胞所占比例进行评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数＜10%为1分，10%～49%为2分，50%～80%为3分，＞80%为4分。染色程度评分与阳性细胞所占比例评分相加，≤1分为（-），2分为（+），3～4分为（++），≥5分为（+++）。其中（-）为阴性，（+）为弱阳性，（++）与（+++）为强阳性[5]。于200倍显微镜下选取5个以上视野进行观察，注意避免坏死区，由2名具有5年以上工作经验且中级以上职称的病理科医师对结果进行判定，结果不一致时请第3名专家进行判定。

1.4 随访

采用门诊或电话方式对患者进行随访，随访截止时间为2019年1月30日。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；采用Spearman相关分析法进行相关性分析；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床特征口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中MT1-MMP、MMP2表达情况的比较

TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴结转移、复发的口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中MT1-MMP的强阳性表达率分别高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移、未复发的口腔鳞状细胞癌患者，差异均有统计学意义（χ2=23.971、9.169、6.556、8.204，P＜0.05）；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴结转移、复发的口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中MMP2的强阳性表达率分别高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移、未复发的口腔鳞状细胞癌患者，差异均有统计学意义（χ2=5.459、5.655、5.032、4.814，P＜0.05）。不同性别、年龄、肿瘤部位、浸润情况口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中MT1-MMP和MMP2的强阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中MT1-MMP、MMP2的表达情况（n=83）

2.2 MT1-MMP与MMP2表达的相关性

Spearman相关分析结果显示，口腔鳞状细胞癌患者中MT1-MMP与MMP2的表达呈正相关（r=0.471，P＜0.05）。（表2）

表2 口腔鳞状细胞癌患者中MT1-MMP与MMP2的表达情况

2.3 生存分析

MT1-MMP强阳性表达患者的中位生存时间为24个月，明显短于MT1-MMP弱阳性/阴性表达患者的32个月，差异有统计学意义（χ2=18.415，P＜0.01）。MMP2强阳性表达患者的中位生存时间为24个月，明显短于MMP2弱阳性/阴性表达患者的33个月，差异有统计学意义（χ2=11.895，P＜0.01）。（图1、图2）

图1 MT1-MMP强阳性（n=37）与弱阳性/阴性（n=46）口腔鳞状细胞癌患者的生存曲线

图2 MMP2强阳性（n=41）与弱阳性/阴性（n=42）口腔鳞状细胞癌患者的生存曲线

3 讨论

口腔鳞状细胞癌是临床中最常见的口腔癌，其发病率呈逐年上升之势。恶性肿瘤细胞从原发病灶脱离并向远处侵袭转移是患者预后不良的一个重要原因，口腔癌患者死因多为转移或复发。口腔癌的发生发展及转移是一个由多方面因素影响的过程，其中细胞外基质是恶性肿瘤细胞侵袭转移的第一道防线[6-8]。MMP是降解细胞外基质的主要酶，在恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等方面均具有关键的调控作用[9]。

本研究结果显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴结转移、复发的口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中MT1-MMP和MMP2的强阳性表达率分别高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移、未复发的口腔鳞状细胞癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同性别、年龄、肿瘤部位、浸润情况口腔鳞状细胞癌患者口腔鳞状细胞癌组织中MT1-MMP和MMP2的强阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。说明口腔鳞状细胞癌患者中MT1-MMP和MMP2的表达情况与TNM分期、分化程度、淋巴结转移情况及预后情况有关。虽然大部分MMP以可溶性酶原的形式存在，但近年来越来越多的膜型MMP被发现[10-13]：①MT1，2，3及5-MMP主要以Ⅰ型跨膜区与膜相连；②MT4、6-MMP以糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）与膜相连接；③MT23-MMP通过Ⅱ型跨膜区相连。其中MT1-MMP为首个鉴定出来的膜型MMP，目前已被证实在前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤组织中高表达。MT1-MMP不仅可直接或间接降解细胞外基质，从而为恶性肿瘤的迁移侵袭提供便利，还可脱落细胞表面分子并具有激活细胞外信号调节激酶的作用，从而增强细胞的迁移能力。因此，对口腔鳞状细胞癌患者中MT1-MMP的表达水平及其与临床特征的关系进行分析具有重要意义。MMP2是MT1-MMP激活产物，为锌离子依赖性内肽酶，研究显示，其可降解Ⅳ、Ⅴ型胶原及明胶等细胞外基质，从而发挥调节肿瘤血管生成及细胞生长的作用，被证实在多种恶性肿瘤组织中明显高表达[14]。本研究的相关性分析结果显示，MT1-MMP与MMP2的表达呈正相关（P＜0.05）。其原因可能是MT1-MMP可降解细胞外基质中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及明胶、纤连蛋白、纤维蛋白等大分子，同时可介导激活MMP2，从而进一步降解更多的细胞外基质，导致肿瘤侵袭及转移。MMP2酶原经MT1-MMP催化后与组织金属蛋白酶抑制物2（tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2）的 N 端相连，使TIMP2的C端与MMP2酶原的血红素样区域在空间上结合，该三聚体使MMP2酶原聚集于细胞表面，而与TIMP2结合的MTI-MMP易于激活MMP2酶原，两者表达具有协同作用，因此表现为正相关[15]。本研究的生存分析结果显示，MT1-MMP强阳性表达患者的中位生存时间为24个月，明显短于MT1-MMP弱阳性/阴性表达患者的32个月，差异有统计学意义（P＜0.01）。MMP2强阳性表达患者的中位生存时间为24个月，明显短于MMP2弱阳性/阴性表达患者的33个月，差异有统计学意义（P＜0.01）。提示MT1-MMP及MMP2阳性表达可能是口腔鳞状细胞癌发展过程中的两个分子事件，可引起患者预后不良，可能与上述基因表达异常可促进口腔鳞状细胞癌浸润及转移有关。

综上所述，口腔鳞状细胞癌患者中MT1-MMP、MMP2的表达情况与TNM分期、分化程度、淋巴结转移、复发及预后有关，强阳性表达患者的预后更差，MT1-MMP、MMP2对口腔鳞状细胞癌患者的预后预测具有一定的价值。