Wee1激酶作为肿瘤治疗靶点的研究进展△

刘智慧，孟峻

1内蒙古医科大学研究生学院，呼和浩特 010000

2内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特 010000

研究表明，细胞修复受损伤的DNA是通过细胞周期检查点实现的[1]。在正常细胞中，受损的DNA通常于G1/S期检查点进行修复，而大多数恶性肿瘤细胞于G1/S期检查点存在修复缺陷，主要与TP53基因的失活有关。因此，在多数情况下，肿瘤细胞会依赖G2/M期检查点来修复受损的DNA。G2/M期检查点主要依赖于Wee1蛋白激酶和细胞分裂周期因子25（cell division cyclin 25，CDC25）对细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1，又称CDC2）进行翻译后修饰。Wee1在第15位酪氨酸残基（tyrosine 15，Y15）处磷酸化CDK1，在DNA复制过程中造成G2/M期阻滞[2]。上述分子事件为细胞有丝分裂前的DNA修复提供了检查点，但在DNA损伤的背景下抑制细胞周期检查点会导致损伤持续，最终导致细胞凋亡，这是无法弥补的遗传损伤。早期临床研究主要集中在DNA损伤剂存在的情况下调节Wee1的活性和废除G2期DNA损伤修复检查点，利用有丝分裂灾难的概念作为抗肿瘤活性的机制。体外研究表明，Wee1在稳定复制叉和同源重组修复中也起着重要作用[3]。Wee1在DNA修复中发挥了更大的作用，进一步支持了其作为恶性肿瘤治疗中可行治疗靶点的有效性。

1 Wee1在细胞周期和DNA 损伤修复中的作用

细胞周期检查点与细胞周期阻滞和DNA损伤反应的关系密切，对修复和维持基因组的完整性具有重要意义。p53主要通过ATM（ATR）/CHK1（CHK2）-p53/MDM2-p21通路诱导持续或永久性的G1期阻滞。但是，目前研究表明，多数肿瘤存在p53基因的突变和缺失，这就更加依赖于G2/M期的检查点，而Wee1是G2/M期阻滞的关键激酶[4]。Wee1通过磷酸化CDK1、调节CDK1/细胞周期蛋白B（cyclin B）复合物的活性，从而实现对细胞周期的调控。作为G2/M期检查点的组成部分，Wee1决定进入有丝分裂的时间点，并抑制细胞周期的早期进展，同时也参与细胞对DNA的损伤反应[5-6]。Wee1还通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）的磷酸化状态维持DNA复制过程中复制叉的稳定[7]。

2 Wee1蛋白激酶抑制剂

MK-1775是一种高效的、选择性的Wee1小分子抑制剂，属于吡唑嘧啶衍生物，其半抑制浓度（50%inhibiting concentration，IC50）为 5 nmol/L[8]。MK-1775与放疗、化疗相结合的多项临床试验（Ⅰ期和Ⅱ期）正在进行中，包括以下试验：①作为肉瘤细胞和难治性实体瘤的单一疗法[9-10]；②作为乳腺癌的单一疗法[11]；③联合吉西他滨、5-氟尿嘧啶、顺铂和卡铂在卵巢癌和结肠癌中的应用[12-13]；④联合放射治疗在胶质母细胞瘤中的应用[14]；⑤联合吉西他滨在胰腺移植瘤中的应用[15]。上述研究表明Wee1蛋白激酶抑制剂在临床上既可作为单一治疗方法，亦可与传统的DNA损伤剂联合使用。

3 Wee1蛋白激酶抑制剂对不同肿瘤细胞的靶向治疗作用

3.1 Wee1蛋白激酶抑制剂与乳腺癌细胞

一项评估Wee1沉默对乳腺癌细胞系MCF-7（携带野生型p53）和MDA-MB-468（含突变型）抑瘤作用的研究发现，敲除Wee1基因对细胞凋亡因子p53、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）的表达产生影响，结果发现，Wee1沉默可使MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞株的活力降低50%以上；DNA含量测定结果显示，沉默1周后，细胞的凋亡数量明显增加；Wee1蛋白激酶抑制剂也诱导了乳腺癌细胞中p53的表达上调，并且两种细胞株中VEGF和Bcl-2的表达水平均明显降低[16]，表明抑制Wee1可导致乳腺癌细胞G2期阻滞消失，进而导致细胞凋亡，而乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-468对Wee1沉默的敏感性似乎与p53的表达水平一致。抑制Wee1会使p53缺陷的肿瘤细胞对放化疗敏感，其原因可能是由p53突变的肿瘤细胞G1检查点缺失和Wee1或CHK1抑制后G2检查点缺失的联合作用导致的，其共同促进细胞增殖，尽管存在未修复的DNA损伤。目前，针对人类表皮生长因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性乳腺癌患者的治疗策略是使用HER2受体靶向药物曲妥珠单抗，但约70%的患者发生了对曲妥珠单抗抵抗的现象[17]。同时，新的证据表明，肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）与曲妥珠单抗抵抗密切相关，其促进了肿瘤复发和转移[18]。Sand等[19]的研究表明，MK-1775通过抑制肿瘤细胞的活性和增殖以及诱导其凋亡从而靶向曲妥珠单抗耐药的HER2阳性乳腺癌细胞；该研究还发现，MK-1775是通过抑制黏蛋白1（mucin 1，MUC1）的表达从而靶向诱导CSC的形成。其中，MUC1是一种评价抗曲妥珠单抗功能性的生物标志物，其裂解产物在肿瘤细胞和胚胎干细胞中充当生长因子受体[20]。Mir等[21]发现Wee1抑制剂可以克服CSC对辐射的抵抗。Zhou等[22]证明了Wee1或CHK1靶向药物与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂联合治疗对某些白血病干细胞样细胞有效。由此可以假设MK-1775也可以有效地靶向其他恶性肿瘤，但这些恶性肿瘤既往由于CSC亚群而表现出对一线治疗的抵抗，因此仍需进一步验证。

3.2 Wee1蛋白激酶抑制剂与黑色素瘤细胞

通过靶向关键细胞的途径治疗黑色素瘤已经取得了重大进展，但许多患者对治疗产生了耐药性或治疗后复发，因此仍需寻找其他靶点。微小RNA（microRNA，miRNA）-155对黑色素瘤细胞的生长具有抑制作用[23]。一项检测黑色素瘤中miRNA-155表达情况的研究发现，大多数黑色素瘤中的miRNA-155的表达水平较低，但不能预测患者的预后情况；在小鼠实验性转移模型中发现miRNA-155、Wee1的表达情况与黑色素瘤是否发生转移有关[24]，确认了Wee1是miRNA-155的新靶点，表明miRNA-155的高表达和Wee1的沉默均可减少小鼠模型中黑色素瘤细胞的转移，且其能够通过调节Wee1激酶的表达从而调控黑色素瘤的转移，Wee1也对细胞周期具有调节作用。miRNA-155、Wee1与其他驱动黑色素瘤生长和转移的细胞过程的关系尚待今后的研究进一步阐明，为黑色素瘤的靶向治疗提供新的理论依据。

3.3 Wee1抑制剂与结直肠癌细胞

结直肠癌是男性第二高发的恶性肿瘤，仅次于前列腺癌[25]。早期筛查可降低结直肠癌的发病率和病死率[26]。然而，传统化疗药物对晚期结直肠癌患者的治疗效果不佳，导致晚期患者预后差。有研究表明，抑制Wee1的表达仅能增强DNA损伤相关药物和放疗对p53缺陷的肿瘤细胞的作用[27]。但也研究表明，Wee1对p53野生型和突变型肿瘤均具有化疗增敏效果[28]。Yin等[29]通过分析Wee1抑制剂MK-1775对p53突变型结肠癌细胞HT29和SW480的抗肿瘤作用发现，MK-1775能明显抑制结肠癌细胞的增殖，并诱导其凋亡。有研究已发现，蛋白质印迹法（Western blot）检测结果显示，MK-1775可以剂量依赖性地增加DNA损伤标志物组蛋白H2A的一种亚型（γ-H2AX）。MK-1775还可提高HT29和SW480细胞对伊立替康的敏感性[30-31]，与相关研究结果一致[29]。虽然MK-1775单药治疗在p53突变的结肠癌细胞中可以起到抗肿瘤作用，但由于靶向细胞周期检查点的药物具有毒性，因此，治疗剂量是一个重要问题。有研究采取了适当的策略以提高肿瘤细胞对细胞毒性效应的敏感性[32-33]。

3.4 Wee1抑制剂与肺癌细胞

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理类型。早期NSCLC以手术、辅助化疗或放疗为主，晚期NSCLC患者主要采取针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）/间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）/鼠类肉瘤病毒癌基因同源物 B1（v-raf murine sarcoma viraloncogene homolog，BRAF）等基因突变的靶向治疗和免疫治疗方法[34-35]。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是EGFR突变的NSCLC的一线治疗药物。但是，治疗后9～14个月，接受EGFR-TKI治疗的患者不可避免地会产生耐药性。有研究表明，在EGFR-TKI耐药细胞系中，Wee1的表达水平较高，并且随着G2/M细胞周期的延长，Wee1的表达水平逐渐增加；58.3%（7/12）的获得性伊克替尼/吉非替尼耐药患者的Wee1表达水平高于其初始表达水平；当敲除EGFR-TKI耐药的H1299和PC9/G2细胞的Wee1基因后，顺铂和吉西他滨对两种细胞株的作用增强，主要体现在H1299组顺铂的IC50值由 8.64 μg/ml降至 3.10 μg/ml，而 PC9/G2 组顺铂的IC50值由3.66 μg/ml降至0.97 μg/ml；表明Wee1基因的敲除可增强EGFR-TKI耐药的NSCLC的化疗敏感性[36]。此外，Liu等[37]对663例NSCLC患者进行了Wee1基因多态性与化疗疗效相关性的研究，结果显示，Wee1 rs3910384 G/G纯合基因型晚期NSCLC患者经顺铂和吉西他滨方案治疗后，总生存期延长13.5个月，无进展生存期延长3.2个月，3年生存期延长13.5个月，说明Wee1 rs3910384 G/G纯合基因型晚期NSCLC患者对顺铂和吉西他滨化疗方案敏感。因此，Wee1 rs3910384 G/G纯合基因型可作为一个潜在的工具来决定化疗方案，以促进NSCLC患者个性化治疗的实现。

3.5 Wee1抑制剂与胰腺癌细胞

胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDA）是一种致死性疾病，5年生存率低，缺乏有效的靶向治疗方案是其主要原因[25]。尽管从PDA基因组测序中收集了大量的遗传知识，但目前尚无美国食品药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的靶向治疗PDA特定遗传变异的有效方案。有研究证明，PDA细胞中RNA结合蛋白Hur的沉默会使PDA细胞对某些DNA损伤剂敏感，而Hur的过表达会引起抵抗，这与Hur对Wee1表达的快速上调有关[38]。当DNA出现损伤时，Hur对Wee1表达的调节作用是通过促进CDK1的磷酸化从而激活G2/M期检查点实现的。这种新的应激反应机制支持PDA的耐药表型，并证明Wee1的快速翻译可防止PDA细胞发生灾难性DNA损伤[38-39]。Kausar等[40]研究发现，MK-1775可使同源重组（homologous recombination，HR）功能正常的PDA细胞对吉西他滨化疗敏感，尽管Wee1的抑制机制与G2/M期检查点的取消有关，但此种机制可能不足以使HR功能正常的PDA细胞致敏。相反，根据研究结果更支持这样的假设，即Wee1的抑制对化疗的敏感性与HR的抑制有关，持续的辐射能够使DNA发生损伤。因此，抑制HR的修复是MK-1775治疗胰腺癌的一个重要作用机制，推断MK-1775与化疗联合治疗胰腺癌可能有效。

4 小结与展望

MK-1775在多种恶性肿瘤细胞中具有细胞毒性，其机制是由于DNA复制过程中DNA损伤后未及时修复而提前进入分裂期从而引起肿瘤细胞凋亡。MK-1775对Wee1的化学抑制作用可以加强各种DNA损伤剂的细胞毒性，并且在p53缺失的恶性肿瘤中表现得更加明显，亦支撑了G1检查点缺陷时肿瘤在很大程度上依赖G2检查点逃避有丝分裂的致命性的观点[41]。MK-1775单一用药或与其他化疗药物联合使用对多数恶性肿瘤均表现出较强的抗肿瘤活性。然而，目前仍存在一些问题，如当Wee1抑制剂与DNA损伤药物联合使用时，Wee1的表达水平在联合用药的过程中是否能够保持稳定；MK-1775的疗效是否与其他分子环境等有关。因此，未来的研究需要确定细胞周期检查点、DNA损伤修复和DNA复制对Wee1抑制剂单独用药或与其他药物联合治疗肿瘤时的作用。