衰老微环境与肿瘤△

程钰，于中阳，胡凯文

1北京中医药大学第二临床医学院，北京 100029

2北京中医药大学东方医院肿瘤科，北京 100078

近年来，人们发现癌症的发病率呈年龄相关性的增长。流行病学研究显示60岁以上人群的癌症诊断率可增加两倍余，中位诊断年龄为65岁，中位死亡年龄达74岁[1]。世界卫生组织预计至2050年，世界60岁以上人口将超过20亿，其中中国或成为老龄人口最多的国家。衰老是随着时间的推移，机体功能储备丧失，导致组织内稳态降低和年龄相关疾病增加的状态[2]。衰老与肿瘤之间的关系存在很大争议，虽然已经明确衰老是肿瘤的不利因素，但大量研究显示细胞层面的衰老在胚胎发生、伤口愈合、宿主免疫甚至抑制肿瘤上具有积极作用。衰老概念上的混淆是该矛盾出现的主要原因。与宏观概念的衰老不同，细胞衰老贯穿整个生命过程，是正常的生理现象。虽然衰老细胞的累积是机体衰老的基础，但两者并不完全共享诱导机制和分子标记[3-4]。目前尚不明确导致两者差别的机制，抗肿瘤治疗中对衰老细胞的策略也存在巨大分歧。微环境指的是间质、体液以及相关细胞组成的参与细胞增殖、分化和代谢的生存环境，更能反映局部组织甚至全身机体变化的状态。有证据显示衰老可以编程基质细胞，重塑微环境，从而促进肿瘤发展[5]。微环境衰老的表型特征可以归纳为化学信号改变、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）完整性破坏和免疫衰老，本文便从以上三个方面分述衰老微环境对肿瘤的影响。

1 化学信号

衰老产生的最主要的环境效应是衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）。SASP主要包括蛋白酶、细胞因子、趋化因子、生长因子以及多种调节因子[6]。SASP作为对肿瘤等年龄相关疾病的双刃剑被人们熟知。机体对正常组织的SASP是积极的：细胞因子和趋化因子可以通过促进炎性反应吸引免疫细胞聚集，清除多余的衰老细胞；蛋白酶具有重塑微环境的作用，并与调控免疫细胞进出相关；生长因子参与促进衰老细胞清除后的细胞增殖替换过程[7]。但是随着年龄的增长，衰老细胞出现累积，SASP在“自体/旁分泌衰老”的作用下持续分泌，从而导致衰老加速及肿瘤等年龄相关疾病的发生[8]。例如，细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8的过度分泌会引发老年人全身慢性炎症，并进一步形成免疫抑制环境，导致肿瘤发生风险增加[9]；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以破坏细胞外基质和基底膜，帮助肿瘤细胞侵袭与转移；血管内皮生长因子可以通过生成血管促进肿瘤转移；而部分生长因子可以直接促进肿瘤细胞增殖。最近，一些科学家开始将另一种成分——外泌体，视为SASP的一部分[10]。外泌体具有携带并转移蛋白质、脂质和核酸等生物分子的作用。研究发现，衰老细胞的外泌体数量明显增加且成分与年轻细胞有所不同[11]，这些成分的改变会引起细胞增殖、炎症、免疫逃逸和染色体不稳定，并与癌症密切相关[12]。

SASP并不是一成不变的，他的成分和功能受诱导机制影响，可呈多阶段变化，并最终决定于所有成分的组合作用和受体靶细胞。经典DNA损伤反应是年龄相关衰老的主要依赖途径，该过程通过毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ataxiatelangiectasia mutation，ATM）/GATA结合蛋白4（GATA-binding protein 4，GATA-4）通路激活核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）参与SASP的转录调节[13]。除了该经典途径，近年来研究认为部分衰老压力可以通过蛋白激酶p38控制mRNA稳定性调控SASP，且该途径下产生的SASP与经典途径具有一定差别[14]。SASP成分可呈阶段性改变。细胞衰老初阶段可以分泌具有抗炎作用的IL-1α，当NF-κB和CCAAT增强子结合蛋白β参与转录调控后，便会产生第二阶段SASP，但该阶段的SASP相较于初阶段的SASP似乎不那么“友好”，其中IL-6和IL-8两种主要成分可促进恶性上皮-间充质转化[15-16]。此外，SASP的最终作用是由所有分泌成分的组合决定。例如，微环境的重塑取决于调节因子组织金属蛋白酶抑制剂和MMP的平衡结果[17]，而胰岛素样生长因子结合蛋白则被报道可以促进部分SASP对年龄相关疾病的作用[18]。靶细胞也是影响因素之一，周围细胞如果表达了致病性SASP成分的受体则被称为易病性细胞，而衰老细胞本身如果同样表达这些受体，在自分泌和旁分泌的不断修饰下更易获得致病性特征。

目前，衰老化学信号分泌相关的研究存在多个局限性问题。许多肿瘤相关SASP的研究仍然关注单个因子的表达并分析其直接作用效果，缺少对整体SASP的组合作用和细胞环境的考虑。在实验模型的选择上，癌基因诱导的SASP由于具有简捷、快速的优势更受大部分研究者青睐，但癌基因激活途径诱导的SASP是否能代表衰老的实际情况仍有待商榷。此外，人们对SASP的动态、多阶段特征及其调节机制知之甚少。希望未来能出现更多集中于SASP重编程“调节开关”的相关研究。

2 细胞外基质

ECM是由构成骨架的结构蛋白（胶原蛋白、弹性蛋白）、交通基质与细胞的连接蛋白（纤连蛋白、层粘连蛋白）以及填充空间的蛋白多糖组成的非细胞三维高分子网络。ECM不仅可以为组织提供结构支撑和机械稳定，还可以控制细胞的黏附、凋亡、增殖、迁移等过程[19]。不同组织的基质存在异质性，皮肤、骨骼等致密组织更需要坚硬的保护环境，而乳腺、肺等软组织则相反。微环境衰老表现为ECM结构及力学完整性的破坏，向失去保护的方向重塑[20]。

研究发现，衰老的乳腺以及肺组织会出现基质蛋白沉积以及交联增加的现象[21]。正常的ECM交联可以维持基质结构稳定与弹性。虽然有学者认为在肺组织中的交联增加可能是预防肿瘤侵袭的有利因素[23]，但大部分学者认为交联增加会提高ECM刚性，形成更适合肿瘤发展的僵硬微环境[22]。这种僵硬的微环境改变通过纤连蛋白或者透明质酸（hyaluronic acid，HA）等成分将信号传递到细胞内促进黏着斑形成。此外，该信号转导还可以通过Rho家族介导下游胞内磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，也称AKT）通路促进细胞增殖，Rho家族还可以激活MMP重塑以及激活细胞骨架促进肿瘤的侵袭与迁移[24-25]。近期还有研究认为微环境可以通过调节骨架蛋白改变能量利用方式，促进糖酵解，形成更利于肿瘤的代谢环境[26]。ECM导致的细胞内信号改变还可以反过来加重微环境的僵硬程度，在应力作用下推动纤维排列变化。研究发现，衰老ECM基质排列增加[27]。线性化的胶原纤维可以充当肿瘤迁移的轨道，并通过减少突起进一步提高迁移效率[28]。例如，胶原纤维被拉直并垂直于肿瘤边界排列就是乳腺癌微环境的重要特征之一[29]。微环境衰老还可以促进ECM的矿物质沉积增加微环境硬度。矿化会阻止组织蛋白酶对ECM的降解[30]，造成胶原沉积、交联增加、纤维排列紊乱等一系列促癌性变化[31]。

事实上ECM硬度对肿瘤的促进作用并不是线性增加的，一项数字模型实验发现硬度和侵袭性符合双向关系，肿瘤运动能力还受细胞孔径影响[32]。这或许解释了在皮肤、骨骼等致密组织中衰老ECM反向重塑地更加“柔软”，同样增加了肿瘤的发生风险。年老的皮肤组织胶原蛋白、HA和蛋白多糖连接蛋白1（hyaluronan and proteoglycan link protein 1，HAPLN1）等成分明显减少，造成了基质密度以及胶原交联的减少[33]，这种环境已被证明与黑色素瘤侵袭性和骨转移密切相关[34-35]。上文提及的矿化修饰似乎更偏向于增加软组织癌变风险，实际上，衰老的骨骼发生矿化后，可以通过过度的破骨细胞介导的骨吸收造成骨质疏松表型，并增加骨转移的风险[36]。同样，HA的水平降低或与黑色素瘤的不良预后相关[37]，而在前列腺癌以及卵巢癌中出现了相反的情况[38]。有趣的是，HAPLN1在衰老组织中的缺失除了可以破坏淋巴组织促进肿瘤转移[39]，还具有限制免疫细胞聚集的作用[34]。

3 免疫微环境

衰老的免疫微环境表现为免疫功能下降和免疫抑制，这种现象称之为“免疫衰老”，并常伴随着低度、慢性的炎症状态[40]。随着年龄的增长，第一道固有免疫防线失稳，主要表现为巨噬细胞吞噬作用下降、中心粒细胞迁移失准、自然杀伤（natural killer，NK）细胞功能受损及树突状细胞提呈作用减弱[41-42]。适应性免疫防线同样面临着免疫器官萎缩、抗体亲和力下降以及T细胞与B细胞的幼稚细胞数量减少、记忆细胞增多造成应答多样性下降的危机[43]。这种免疫功能的急剧下降是衰老细胞甚至肿瘤细胞无法及时清除的重要原因。

免疫衰老还表现为免疫抑制。免疫抑制细胞群如髓样来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）、肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）和调节性T细胞（regulatory cell，Treg）在老年组织和血液中显著增加。MDSC是由髓系祖细胞产生的异质性群体，在衰老微环境中更易发挥作用。SASP中的干扰素（interferon，IFN）-γ、IL-4和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β可以活化MDSC，使其发挥抑制NK细胞毒性、T细胞增殖并增加Treg细胞的作用[44]。TAM是浸润于肿瘤组织的巨噬细胞群体，以M2类型为主。巨噬细胞根据其表型和功能可以分为M1型和M2型，M1型主要分泌促炎因子且吞噬、杀伤作用更强，M2型则更偏向于免疫抑制作用。M1/M2平衡才可以维持机体的正常生命活动，但在疾病不同过程、不同组织和不同年龄阶段表达水平不一。老年人淋巴、肺和肌肉组织中的M2型巨噬细胞明显增加，是理想的肿瘤转移前生态位[45]。TAM还可以分泌趋化因子和生长因子促进淋巴管和血管的生成。研究发现衰老组织中Treg细胞数量和免疫抑制功能均明显增加，并可以通过分泌TGF-β和IL-10等因子抑制效应T细胞[46]。此外，免疫检查点如程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）的年龄依赖性表达增加也是免疫抑制的主要原因。

衰老的微环境中SASP、年龄相关的肠道微生物群、肥胖和组织退化一起推动了炎性反应[47]。并且，微环境中抗炎因子成分同步增加，与促炎因子共同维持着低度、慢性的炎症状态。这种慢性炎症的刺激容易导致免疫细胞转化和免疫检查点信号改变，从而产生免疫抑制。许多研究早已证明了这种现象：例如高水平的炎性因子IL-6同时与患者的年龄和预后相关[48]；在慢性炎症模型中可发生继发性MDSC和Treg细胞浸润增加[49]。近年来，一些炎症相关微小RNA（microRNA，miRNA）如miRNA-19b、miRNA-126和miRNA-146a的年龄相关性也被认为是癌症进展的原因之一。

4 小结与展望

目前针对衰老的相关抗肿瘤治疗策略仍然集中在细胞衰老上。由于细胞层面的衰老具有肿瘤抑制作用，因此诱导衰老治疗已经成为临床常见的手段之一。例如，利用低剂量的电离辐射、化疗以及靶向治疗引起治疗诱导性衰老（therapy-induced senescence，TIS），这似乎是一种“饮鸩止渴”的方法，大量衰老的肿瘤细胞累积，以及周围环境老化带来的免疫和SASP改变会引发更高的复发率与耐药性[50]。又有研究者提出清除衰老细胞调和TIS的危害，B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）蛋白家族可以促进衰老细胞凋亡和自噬，但是临床反馈不良反应较大；达沙替尼和槲皮素的联合用药弥补了前者的缺点，但因效果有限难以推进。清除衰老细胞若无法做到特异性靶向则危害更大，细胞衰老仍能维持自身部分功能及多样性，而细胞凋亡常带来剩余细胞肥大或干细胞增殖代偿的危害。

局限于衰老细胞的治疗策略已经陷入困境，针对衰老微环境的研究展现出更多的可能。关于SASP的治疗手段已经脱离了单个组件靶向的限制，人们开始意识到SASP整体重塑的价值。从SASP阶段性改变入手，二甲双胍被证明可以通过阻断IL-1α下游的NF-κB限制炎症过程[51]，雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）抑制剂雷帕霉素可以减少膜结合IL-1α的表达，改善衰老成纤维细胞对前列腺癌细胞增殖的促进作用[52]。信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可以调节SASP的免疫抑制，通过抑制非受体型蛋白酪氨酸激酶（Janus kinase，JAK）重编程SASP激活免疫监视[53]。免疫治疗是目前肿瘤领域的研究热点，但针对75岁以上人群的临床研究仍显不足。老年人PD-1/程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）的表达明显升高，理论上免疫检查点治疗应该获得更好的疗效。部分小鼠实验提示免疫治疗在老年群体中疗效更佳的可能，但临床试验结果却不尽如人意，这可能受到T细胞的耗竭和Treg细胞增加程度的影响[54-55]。并且需要注意的是，免疫治疗相关不良反应在老年人中更为常见[56]。最后，目前针对ECM的治疗手段仍然没有实质进展，MMP抑制剂热点已经成为过去式，但近几年有研究如JNJ0966和Fab 3369提示高选择靶向特定MMP的治疗可能[57-58]。

衰老是整体环境的改变，不能单纯地针对衰老群体与年轻群体的差异进行补救试验，这可能会破坏已摇摇欲坠的衰老平衡。此外，目前的指南性治疗手段很少进行老年小鼠模型研究和临床验证。经过换算，小鼠18个月龄才符合人类60岁的水平，而目前大部分的实验小鼠模型多采用6～8个月龄，远低于这一水平。不管是细胞还是微环境，衰老在肿瘤中的作用已经受到越来越多学者们的重视。希望在未来与该领域的学者们共同探索，从衰老微环境角度为肿瘤患者带来更多有效的治疗方案。