血清中期因子、可溶性人类白细胞抗原-G 在甲状腺癌中的诊断价值

张驰，石岚，王培培，李月香，张诗卉

北京新里程肿瘤医院检验科，北京100161

甲状腺癌是临床常见的头颈部恶性肿瘤，近年来，中国部分地区甲状腺癌的发病率逐年增高。侵袭与转移是导致甲状腺癌患者死亡的重要原因。肿瘤的转移和浸润是复杂的动态过程，与肿瘤基因失控以及细胞因子和其受体的相互作用关系密切[1]。中期生长因子属于肝素结合生长因子，研究显示，其在正常人体血清和组织中含量极少，但是在恶性肿瘤组织中呈现高表达，对于胚胎发育期细胞的生长和分化具有重要影响，与恶性肿瘤的发生、发展关系密切。人类白细胞抗原G属于非经典的组织相容性复合体Ⅰ类抗原，其异常表达会导致肿瘤细胞逃避肿瘤的免疫监视系统，在多种恶性肿瘤中的表达异常升高[2]。目前，临床关于联合分析中期生长因子和人类白细胞抗原G在甲状腺癌中的表达情况及其与患者预后关系的报道较少见。因此，本研究探讨中期因子（midkine，MK）、可溶性人类白细胞抗原-G（soluble human leukocyte antigen-G，sHLA-G）在甲状腺癌中的表达水平及对其甲状腺癌的诊断价值，以期为临床提供参考，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月至2019年12月于北京新里程肿瘤医院接受治疗的89例甲状腺癌患者和70例甲状腺良性病变（甲状腺腺瘤）患者，分别作为甲状腺癌组和甲状腺良性病变组。纳入标准：①经病理学检查确诊为甲状腺癌或甲状腺腺瘤；②无内分泌治疗史；③年龄≥18岁；④依从性好。排除标准：①合并急慢性感染；②合并肝、肾功能不全；③合并免疫系统疾病、血液系统疾病及其他严重疾病；④入组前接受过免疫调节剂、激素类药物等的治疗。89例甲状腺癌患者中，女74例，男15例；平均年龄为（46.67±9.87）岁；平均体重指数为（22.45±2.10）kg/m2。70例甲状腺良性病变（甲状腺腺瘤）患者中，女60例，男10例；平均年龄为（47.10±10.02）岁；平均体重指数为（22.23±2.06）kg/m2。另选取50例同期健康体检者作为健康对照组，其中，女41例，男9例；平均年龄为（46.84±8.88）岁；平均体重指数为（22.50±2.19）kg/m2。3组研究对象的性别、年龄、体重指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经过医院医学伦理委员会审批通过，所有研究对象均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 检测方法

抽取3组研究对象的空腹静脉血5 ml，以3000 r/min的离心速度离心10 min，分离血清，设置标准品孔、样本孔和空白孔，将50 μl不同浓度的标准品和样本加入孔中，加入100 μl由辣根过氧化物酶标记的检测抗体，空白孔既不加标准品、待测样品，也不加检测抗体。封住反应孔，在37℃恒温箱内放置60 min。倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干，将350 μl洗涤液加满孔内，静置1 min后倒掉，拍干，重复4～5次。加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。将50 μl终止液分别加入每孔，在450 nm波长下测定各孔的光密度值（optical density，OD）值，以标准品浓度作为横坐标，对应的OD值作为纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。所用试剂均由上海江莱生物科技有限公司提供，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线和曲线下面积分析MK、sHLA-G对甲状腺癌的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组研究对象血清MK、sHLA-G水平的比较

甲状腺癌组、甲状腺良性病变组、健康对照组患者的血清MK、sHLA-G水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。甲状腺癌组患者的血清MK、sHLA-G水平均高于甲状腺良性病变组和健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；甲状腺良性病变组患者的血清MK、sHLA-G水平均高于健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 3组研究对象血清MK、sHLA-G水平的比较（±s）

表1 3组研究对象血清MK、sHLA-G水平的比较（±s）

注：a与健康对照组比较，P＜0.05；b与甲状腺良性病变组比较，P＜0.05

组别甲状腺癌组（n=89）甲状腺良性病变组（n=70）健康对照组（n=50）F值P值MK（pg/ml）372.26±101.14a b 288.87±100.54a 210.01±76.64 89.944 0.000 sHLA-G（ng/ml）42.26±11.15a b 31.54±9.88a 6.87±1.22 21.064 0.000

2.2 甲状腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平与临床特征的关系

TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的甲状腺癌患者的血清MK水平均高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的甲状腺癌患者，差异均有统计学意义（t=-2.857、2.093，P＜0.05）；肿瘤直径≥2 cm、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的甲状腺癌患者的血清sHLA-G水平均明显高于肿瘤直径＜2 cm、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的甲状腺癌患者，差异均有统计学意义（t=-5.977、-9.895、4.217，P＜0.01）。（表2）

2.3 血清MK、sHLA-G水平对甲状腺癌的诊断价值

血清MK、sHLA-G水平诊断甲状腺癌的曲线下面积分别为 0.701（95%CI：0.596～0.806）和 0.804（95%CI：0.720～0.889），P＜0.05，截断值分别为301.24 pg/ml和39.79 ng/ml，灵敏度分别为62.0%和56.0%，特异度分别为76.0%和99.4%。（图1）

3 讨论

甲状腺癌可发生于各个年龄段，一般女性的发病率高于男性，患者早期出现颈部缓慢增长的肿物，临床体征不明显，发展至晚期，肿物会对人体组织造成压迫与侵犯，导致患者出现吞咽、呼吸和发音功能的异常，严重影响了患者的生活质量和生命安全[3-4]。甲状腺肿瘤的发病因素较多，包括电离辐射、碘摄入异常以及遗传等，因此，早发现、早鉴别对甲状腺肿瘤的后期诊治和预后评估具有重要意义[5]。研究发现，恶性肿瘤具有自主性生长、浸润、转移、逃避人体免疫系统的攻击等特性，保持人体内环境的稳态可以抑制肿瘤的发生，而组织内环境稳态失衡就会促进恶性肿瘤表型的出现[6]。近年来，随着临床诊疗水平的提升，越来越多的甲状腺疾病早期即可被诊断，但是，对甲状腺结节的诊断存在较高的误诊率和漏诊率，甲状腺结节与其他甲状腺疾病可能存在部分重叠性的影像学特征，如超声虽然对于囊性病变的诊断准确度较高，在判断结节的大小、部位以及引导穿刺方面具有明显优势，但对结节良恶性质的鉴别诊断价值一般[7-8]。分子生物学已经证实各种致瘤因素均会造成局部组织细胞基因无法调控细胞正常的生长、凋亡过程，从而出现异常增生，影响肿瘤患者的疗效和预后。肿瘤的转移是一个复杂的、多步骤的连续过程，期间会受到多种相关基因的调控，包括肿瘤转移基因的激活、肿瘤转移抑制基因的失活和多种基因之间的相互作用[9]。

图1 血清MK、sHLA-G 水平诊断甲状腺癌的ROC曲线

本研究分析了MK、sHLA-G在甲状腺癌中的表达情况，sHLA-G属于非经典的主要组织相容性复合体，可通过多种机制参与母胎免疫耐受的诱导与维持。有研究通过检测发现，仅sHLA-G在肿瘤组织中表达，其余亚型则均未检测到，正常人体sHLA-G主要由树突状细胞、单核细胞等产生，通过体液循环可以存在于全身的组织器官中，发挥抗肿瘤免疫效应，保护肿瘤细胞逃逸宿主免疫监视[10]。研究发现，sHLA-G一方面可以直接抑制细胞的免疫功能，阻断效应细胞作用的发挥；另一方面还可以通过诱导生成调节细胞调节人体免疫功能[11]。有研究发现，恶性肿瘤患者腹腔积液中的sHLA-G浓度高于良性肿瘤患者腹腔积液中的sHLA-G浓度，提示sHLA-G对肿瘤的良恶性质具有鉴别诊断意义[12]。MK是肝素结合生长因子，与器官形成关系密切，在成年组织中很少表达，与肿瘤的发生发展关系密切[13]。在细胞的表面存在对葡氨聚糖肝素和硫酸肝素具有高度亲和力的多肽，MK表达异常会导致同细胞表面上述多肽的结合异常，导致恶性肿瘤生长、血管生成，同时还可以促进嗜中性粒细胞与巨噬细胞等多种细胞的移动，有助于肿瘤细胞的浸润和转移[14]。另外，MK的寡核苷酸反义链可以抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤血管的形成，小鼠直肠肿瘤与神经母细胞瘤中均存在MK缺失，提示利用MK基因产物缺失并阻断细胞信号传导可能能够为甲状腺恶性肿瘤提供了新的治疗途径，为临床拓展新的思路与方法[15]。

本研究发现，甲状腺癌患者的血清MK和sHLA-G水平高于甲状腺良性病变和健康受试者，提示MK和sHLA-G在甲状腺癌中高表达。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的甲状腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平均高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的甲状腺癌患者（P＜0.05），肿瘤直径≥2 cm的甲状腺癌患者的血清sHLA-G水平明显高于肿瘤直径＜2 cm的甲状腺癌患者（P＜0.01），提示MK、sHLA-G水平与TNM分期、淋巴结转移有关，sHLA-G水平还与肿瘤直径有关。ROC曲线分析发现，血清MK、sHLA-G水平诊断甲状腺癌的ROC曲线下面积分别为0.701和0.804，灵敏度分别为62.0%和56.0%，特异度分别为76.0%和99.4%，提示血清MK、sHLA-G水平对甲状腺癌的诊断具有重要的意义。本研究发现了MK、sHLA-G的过表达与甲状腺癌患者肿瘤直径、恶性程度、淋巴结转移的关系密切，与以往研究相似，同时通过绘制ROC曲线进一步证实了其在甲状腺癌诊断中的灵敏度和特异度，为临床合理寻找诊断甲状腺癌标志物物提供了依据。

综上述所，甲状腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平较高，与患者的TNM分期、淋巴结转移和肿瘤直径有一定关系；血清MK、sHLA-G水平在甲状腺良恶性病变的鉴别诊断中有一定的应用价值。但是，本研究纳入的病例数量较少，随访时间短，而且对MK、sHLA-G水平与患者预后的关系未进行分析，对具体机制和相关信号通路未进一步阐述，故在今后的研究中，仍需要通过建立动物模型以及开展细胞学研究深入论证。