亨氏马尾藻岩藻聚糖结构鉴定及其对氧化型低密度脂蛋白诱导HMVEC损伤的保护作用

林沛纯，谌素华，王维民，刘海韵，黄丹思，杨志强

亨氏马尾藻岩藻聚糖结构鉴定及其对氧化型低密度脂蛋白诱导HMVEC损伤的保护作用

林沛纯1,2，谌素华2,3，王维民2，刘海韵2，黄丹思2，杨志强2

（1. 广东海洋大学 化学与环境学院，广东 湛江 524088；2. 广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；3. 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518108）

【】探讨4种亨氏马尾藻岩藻聚糖的结构及其对氧化型低密度脂蛋白诱导HMVEC损伤的保护作用。以亨氏马尾藻岩藻聚糖（FD1）为原料，过 Sepharose Cl-6B琼脂糖凝胶柱层析得到组分FS11，对FS11进行化学组成分析和单糖分析，测定F、FD1、FS1、FS11等4种岩藻聚糖的相对分子质量、糖链构象和红外光谱，进行结构鉴定；采用MTT法测定3种岩藻聚糖对HMVEC存活率的影响，研究4种岩藻聚糖对氧化型低密度脂蛋白诱导HMVEC损伤的保护作用。与F、FD1、FS1比，FS11硫酸基和多糖含量最高。FS11中岩藻糖含量高达52.744%；F、FD1、FS1、FS11的相对分子质量分布分别为474 576、459 032、201 285、190 049；I-KI紫外扫描和刚果红实验表明岩藻聚糖具有复杂树状分支和多股螺旋结构；红外光谱结果表明各组分均有O—H、C—H多糖特征官能团、S==O活性特征官能团；加药培养24 h，质量浓度为500 μg/mL和1 000 μg/mL的4种岩藻聚糖（F、FD1、FS1、FS11）均能显著减弱受氧化型低密度脂蛋白损伤的HMVEC的增殖抑制（＜0.01)。尾藻岩藻聚糖对氧化型低密度脂蛋白诱导的HMVEC损伤具有保护作用。

亨氏马尾藻；岩藻聚糖；结构鉴定；诱导损伤；HMVEC

马尾藻（）属褐藻门（Phaeophyta）、墨角藻目（Fucales）、马尾藻科（Sargassaceae）、马尾藻属（）。我国马尾藻种类繁多，资源丰富，但开发利用的程度较低[1]。马尾藻中多糖含量丰富，其特征多糖岩藻聚糖为高度吸湿性多

糖[2]，最早由Kylin在二十世纪初提出并命名[3]。研究发现岩藻聚糖具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗凝血等多种活性[4-10]，目前关于岩藻聚糖结构研究已有重要突破。Gerbst[11]发现岩藻聚糖中存在α糖苷键，Bilan[12]在2010年提出3种岩藻聚糖结构并初步确定硫酸基的位置，黄桂华[13]采用核磁共振（NMR）、高效液相色谱（HPLC）、傅氏转换红外线光谱分析（FTIR）等方法研究岩藻聚糖的结构。马尾藻岩藻聚糖主要成分是L-岩藻糖和硫酸根[14]，其结构特性对生物活性和药物作用有很大影响[15]。

目前，对于岩藻聚糖抗血栓活性的研究多集中在海带（）[13]上，关于马尾藻岩藻聚糖抗血栓活性的研究甚少。本课题组刘海韵[16]采用 DEAE-52 和 Sepharose CL-6B 柱层析法制得不同马尾藻岩藻聚糖组分，发现其对小鼠黑尾血栓有较好的抑制效果，但是其体外抗血栓的机制尚不清楚。本研究采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱层析法对亨氏马尾藻进行分离纯化，得到马尾藻岩藻聚糖，对其进行结构鉴定，并通过使用氧化型低密度脂蛋白诱导HMVEC损伤，研究马尾藻岩藻聚糖对HMVEC的保护作用，为深入研究马尾藻岩藻聚糖对HMVEC的保护作用和抗血栓的作用机制提供实验数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亨氏马尾藻，采自广东省湛江市硇洲岛附近海域，经清洗、晒干、粉碎得到粉末。对粉末采用超声波辅助水提法，经过二次醇沉、脱蛋白和去脂肪得到组分F，将F分别采用DEAE-52、Sepharose CL-6B柱层析法得到组分FD1和FS1。F、FD1和FS1的化学组成和单糖组成参见文献[16]。

人肺微血管内皮细胞（HMVEC）购自北纳创联生物技术有限公司。DEAE-52纤维素购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；PBS缓冲液、DMEM高糖基础培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%-EDTA胰酶均购自gibco公司；双抗（PS）购自Hyclone公司；噻唑蓝（MTT）、氧化型低密度脂蛋白、肝素钠和Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-5100紫外可见光光度计，上海元析仪器有限公司；HR/T20MM高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；LDZX-50 KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；DMI4000B智能型倒置荧光显微镜，德国 Leica 公司；Varioskan Flash全自动酶标仪，美国 Thermo 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 马尾藻岩藻聚糖分离纯化 采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱层析法[16]。用浓度0.1 mol/L的NaCl对FD1进行洗脱，将得到的样品命名为FS11。

1.3.2 化学组成测定 苯酚硫酸法[17]测定多糖含量；半胱氨酸盐酸盐法[18]测定L-岩藻糖含量；明胶比浊法[19]测定硫酸根含量；间羟基联苯法[9]测定糖醛酸含量。

1.3.3 单糖组成测定 采用高效液相色谱法测定FS11的单糖组成。色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱为XDB-C18，柱温为30 ℃，柱流量为1.0 mL/min，以磷酸二氢钾缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.6）/乙腈（体积比83∶17）为流动相，进样量为10 µL。

1.3.4 相对分子质量分布测定 采用高效液相色谱法测定F、FD1、FS1和FS11的相对分子质量，分别称取一定量的各相对分子质量葡聚糖标准品，以0.2 mol/L NaCl 为溶剂配制成10 mg/mL的溶液并过滤。水相仪器为PL-GPC 220，检测器为PL-GPC 50（RI），色谱柱采用PL aquqgel-OH MIXED 8 μm 两根串联，以0.2 mol/L NaNO3和0.01 mol/L NaH2PO4为流动相，调整流速为1 mL/min。

1.3.5 多糖糖链测定 配置1 mg/mL岩藻聚糖样品溶液，取2 mL，加入1.2 mL I-KI试剂，混匀后在300 ~ 700 nm波长范围内扫描，根据扫描结果即可判断样品的糖链构象。

以蒸馏水为空白对照，向2 mL蒸馏水中加入2 mL刚果红试剂，混匀，在450 ~ 550 nm波长下进行扫描，记录最大吸光值所对应的波长；滴加NaOH溶液，使其浓度从0.05 mol/L上升到

0.50 mol/L，同上进行扫描。将5 mg多糖样品加入2 mL水溶解，加入2 mL刚果红试剂，混匀，重复以上步骤。以NaOH浓度为横坐标，样品最大吸收波长为纵坐标，作图。将样品的曲线与刚果红曲线进行比较。

1.3.6 红外光谱测定四种岩藻聚糖组分 将溴化钾用玛瑙研钵研磨，过孔径0.147 mm网筛，红外灯下干燥4 h，以溴化钾压成半透明薄片做空白，以样品与溴化钾混合制成压片，在4 000 ~ 400 cm-1范围内进行扫描[20]。

1.3.7 马尾藻岩藻聚糖对HMVEC存活影响 选择汇合度80%以上的HMVEC，用胰酶酶解成细胞悬液，接种到96孔板中，细胞密度为30 000 mL-1。培养24 h，加入质量浓度为62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0 μg/mL的马尾藻岩藻聚糖溶液（F、FD1、FS1）、空白对照组和质量浓度为50、500、5 000 μg/mL的肝素钠作为阳性对照组，分别培养24、48、72 h，后进行MTT检测。96孔板内加入100 μL完全DMEM培养液和20 μL 5 mg/mL MTT溶液，置于培养箱中反应4 h，弃去上清夜，加入150 μL DMSO，在室温下震荡10 min，最后于570 nm测值[21]，计算HMVEC存活率。

存活率=/0×100%，

式中，为实验组酶标仪所测量的值，0为空白组所测量的值

1.3.8 氧化型低密度脂蛋白造模浓度与造模时间的确定 根据杨为亚[22]的方法并略做修改。培养细胞至进入对数期，加入质量浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL的氧化型低密度脂蛋白溶液和空白对照组，培养12 h，用倒置荧光显微镜观察并记录细胞生长状态，参照1.3.7 MTT方法测定值，计算HMVEC存活率。

1.3.9 马尾藻岩藻聚糖对受氧化型低密度脂蛋白损伤的HMVEC增殖影响 细胞培养12 h后，弃去上清液。加入由完全培养基配制的500 μg/mL和1 000 μg/mL 的F、FD1、FS1、FS11和500 μg/mL肝素钠，每孔100 μL，培养12 h后，加入100 μL的氧化型低密度脂蛋白溶液造模，培养12 h，按照1.3.8 MTT法测定值，计算HMVEC存活率。

2 结果与分析

2.1 FD1洗脱曲线

FD1的洗脱曲线如图1。由图1可得，FD1经过Sepharose Cl-6B凝胶柱之后，除极少量的小分子被分离外，大部分组分集中在一个糖峰，将其命名为FS11。

图1 FD1 Sepharose Cl-6B洗脱曲线

2.2 化学组成分析

组分FS11的化学组成分析结果见表1。与FD1[16]比较，组分FS11的四项化学组成指标均有所提高，分别上升11.514%、2.377%、0.493%、1.177%。与F、FS1比较，FS11多糖含量分别提高16.341%和1.339%，硫酸基含量也提高18.445%和17.889%。

2.3 单糖组成分析

FS11的单糖组成分析结果见表2。表2可知，组分FS11含有阿拉伯糖，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖6种单糖，与F、FD1和FS1结果一致。但4种组分中各种单糖的含量存在差异。单糖组成成分与含量取决于来源和提取方法，Lim[23]使用不同的提取方法从不同的海藻中提取的岩藻聚糖单糖组成也不一样。4个组分均主要由岩藻糖组成，这是岩藻聚糖的主要特征[24]，其中，组分FS11的岩藻糖含量超过50%。

表1 FS11化学组分质量分数

表2 FS11单糖质量分数

2.4 相对分子质量分布

F、FD1、FS1和FS11相对分子质量分布的结果见图2。

图2 4种岩藻聚糖相对分子质量洗脱曲线

从图2中4条洗脱曲线中得出，组分F、FD1、FS1、FS11的洗脱峰值出现的时间分别为12.40、12.70、12.52、12.62 min，计算得到对应组分的重均相对分子质量分别为474 576、459 032、201 285、190 049。分离纯化的方法不同，多糖的相对分子质量分布也会不同[25]。通过对比发现，组分FD1的相对分子质量分布比F窄，而F和FD1分别经过Sepharose-Cl 6B琼脂糖凝胶柱层析后得到FS1和FS11的相对分子质量分布更窄，说明琼脂糖凝胶对不同分子质量的物质有很好的分离作用。

2.5 糖链构象分析

组分F、FD1、FS1、FS11糖链的构象分析结果如图3和图4。

图3可看出，各组分均在350 nm处有吸收峰，在500 nm处均无吸收峰，证明了马尾藻岩藻聚糖的糖链构象为较为复杂的支链结构，可能含有多个树状分支；350 nm处的吸收峰峰型不稳定，但是随着不断地分离纯化，峰与峰之间的间隔变大，峰型变得较为清晰，证实多糖的纯度有所提高。

各个组分的多糖与刚果红结合后，最大吸收波长与刚果红相比明显红移（图4）。根据刚果红可与多股螺旋构象的物质形成配合物从而导致最大吸收波长增大的理论依据，说明刚果红与粗多糖两者形成了配合物，并在碱性条件下形成亚稳区，表明马尾藻岩藻聚糖中存在着多股螺旋构象[26]。

图3 4种岩藻糖的I-KI紫外扫描

2.6 红外光谱分析

组分F、FD1、FS1、FS11岩藻聚糖的红外光谱图见图5。

图5可知，4个组分的红外光谱图大致相似，在2 904.7 ~ 2 920.2 cm-1处有C—H伸缩振动形成的尖锐吸收峰，O—H和C—H形成的吸收峰为多糖类物质的特征吸收峰；1 597.0 ~ 1 631.7 cm-1处有C==O伸缩振动峰，FD1和FS11在该处形成的振动吸收峰较强；在1 228.6 ~ 1 238.3 cm-1处有S==O的伸缩振动，S==O为硫酸基的特征基团；在960.5 ~ 964.4 cm-1处有吡喃环末端次甲基产生横摇振动所形成的小吸收峰；在887.2 ~ 904.6 cm-1处有特征吸收峰，证明多糖组分中含有β糖苷键；在806.2 ~ 831.3 cm-1处的特征吸收基团为α糖苷键和C—O—S。

图4 3种岩藻糖与刚果红结合后的最大吸收波长变化曲线

图5 4种岩藻聚糖红外光谱

2.7 氧化型低密度脂蛋白造模条件确定

图6显示，在造模12 h时，相比于空白组，各浓度组的细胞生长均受到极显著抑制（< 0.01），HMVEC存活率从最高浓度组（100.00 μg/mL）至最低浓度组（6.25 μg/mL）依次为17.17%、27.94%、39.88%、49.66%、58.41%。本研究选用质量浓度50 μg/mL，作用时间12 h为造模条件。

2.8 马尾藻岩藻聚糖对HMVEC存活率的影响

马尾藻岩藻聚糖对HMVEC存活率的影响，结果如图7和图8。

与空白组比较，**表示有极显著差异，< 0.01。

Compared with the control group, ** indicates a very significant difference,< 0.01.

图6 不同浓度氧化型低密度脂蛋白对HMVEC存活率的影响

Fig. 6 Effects of different concentrations of oxidized low-density lipoprotein on HMVEC proliferation rate

图7-a可知，和空白组相比，24 h时各浓度组的存活率均在80%以上，即组分F在24 h对细胞生长没有抑制作用。图7-b可看出，随着组分浓度的增大，3个时间段的细胞存活率呈现出显著的剂量依赖效应。24 h和48 h低浓度组对HMVEC的存活率影响不显著（> 0.05）。图7-c可以看出，24 h和48 h，FS1对HMVEC存活率没有影响。综合以上分析，最终选用岩藻聚糖质量浓度500 μg/mL和1 000 μg/mL用于后续实验，给药培养时间控制在24 h之内。

图8可知，中浓度（500 μg/mL）对细胞影响最小，低浓度（50 μg/mL）和高浓度（5 000 μg/mL）在3个时间段里均不同程度的制约细胞增殖。500 μg/mL中浓度组对细胞存活率的影响不显著（＞0.05）。结合上述马尾藻岩藻聚糖对HMVEC增值的影响分析，决定选择加药培养时间24 h，质量浓度为500 μg/mL，肝素钠的浓度确定与廖敏[27]实验结果一致。

与空白组比较，*表示有显著差异，P < 0.05; **表示有极显著差异，P < 0.01。

与空白组比较，*表示差异显著，< 0.05; **表示差异极显著，< 0.01。

Compared with the control group, *indicates a significant difference,< 0.05, ** indicates a very significant difference,< 0.01.

图8 不同浓度的肝素钠对HMVEC存活率的影响

Fig. 8 Effects of different concentrations of sodium heparin on the survival rate of HMVEC

2.9 马尾藻岩藻聚糖对受氧化型低密度脂蛋白损伤的HMVEC增殖影响

马尾藻岩藻聚糖对受氧化型低密度脂蛋白损伤的HMVEC增殖的影响，结果见表3。

表3 马尾藻岩藻聚糖对氧化型低密度脂蛋白损伤的HMVEC增殖影响

注：与空白组比较，*表示差异显著，< 0.05；**表示差异极显著，< 0.01；与造模组比较，#表示差异显著，< 0.05；##表示差异极显著，< 0.01

Note: Compared with the control group, *indicates a significant difference,< 0.05 ** indicates a very significant difference,< 0.01.Compared with the model group,#indicates a significant difference,< 0.05##indicates a very significant difference,< 0.01.

表3可得，与空白组相比，造模组增殖率最小（< 0.01），500 µg/mL FS11对HMVEC的保护作用最强（< 0.01），其次是1 000 µg/mLFS1（< 0.05）。与造模组比较，其他组分增殖率均显著性提高（< 0.01），说明马尾藻岩藻聚糖对HMVEC有保护作用。当4种组分质量浓度为500 µg/mL时，保护能力从强到弱依次是FS11、FS1、FD1、F。当岩藻聚糖浓度较低时，其相对分子质量分布会影响对HMVEC的保护作用。Lu等[28]发现低相对分子质量分布对乳腺癌细胞增殖的抑制作用强于高相对分子质量。Huang等[29]发现硫酸基含量高的岩藻聚糖比含量低的清除自由基的能力更强。硫酸基和岩藻糖的高含量，可能会产生高密度负电荷的特定序列，这会增强岩藻聚糖的抗凝血和抗血栓形成活性[30]。Ben等[31]研究发现，岩藻糖残基的高硫酸化含量赋予该多糖重要抗凝血作用，FS11硫酸基团高达30%，这可能与其对损伤的HMVEC保护作用强有关。与肝素钠组比较，1 000 µg/mL FD1、500和1 000 µg/mL FS1、500 µg/mLFS11对细胞的保护作用强于阳性对照组Hep。

3 讨论

本研究采用Sepharose Cl-6B琼脂糖凝胶对FD1进一步纯化，得到组分FS11。FS11是一种复杂的硫酸多糖，包含有阿拉伯糖，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖，硫酸基团和糖醛酸。分离纯化后FS11多糖含量高达80.276%，高于课题组前期提取的岩藻聚糖（F、FD1、FS1）[16]。F、FD1、FS1、FS11的主要差异表现在化学组成、分子质量分布和单糖组成。单糖组成、I-KI和刚果红实验结果进一步证实，亨氏马尾藻岩藻聚糖含有6种单糖，具有复杂的支链结构和多股螺旋构象。红外光谱表明，除多糖的特征性官能团O—H、C—H外，岩藻聚糖还含有诸如S==O、次甲基等活性官能团，主要糖键的键型为β糖苷键和α糖苷键。

在正常生理状态下，血管内皮细胞具有抑制血栓形成的功能，一旦内皮细胞受损或者被激活，其正常功能出现异常，这是导致血栓形成的首位因素[32]。潘君枝[33]研究发现，丁苯酚可以通过调控细胞因子的分泌，改善血管内皮细胞，从而抑制血栓形成。氧化型低密度脂蛋白是一种对人体有害的胆固醇，可以导致动脉粥样硬化[34]，从而激发血栓的形成。因此，本研究选择HMVEC作为研究对象，采用氧化型低密度脂蛋白来诱导细胞损伤。肝素钠是传统的抗凝药物，它是通过抑制Xa因子活性，从而抑制凝血和血栓形成[35]，本研究采用它作为阳性对照。本研究发现F、FD1、FS1、FS11四种岩藻聚糖均对HMVEC有保护作用，其中质量浓度500 µg/mL的FS11和1 000 µg/mL的FS1保护作用最强。FS1与FS11的相对分子质量分布相差很小，但FS1的岩藻糖含量高于FS11 ，FS11的硫酸基团含量高于FS1。有报道称岩藻聚糖的活性可能与岩藻糖和硫酸基团的比例相关[16]，岩藻聚糖的浓度可能也与其保护作用有关。本研究发现岩藻聚糖具有保护损伤的HMVEC，但其对血管内皮细胞的作用机制尚需进一步研究。

4 结论

F、FD1 、FS1和FS11这4种岩藻聚糖组分中，FS11纯度最高，其岩藻糖含量和多糖含量最高。亨氏马尾藻岩藻聚糖的结构特征为具有多股螺旋构象且含有较长侧链和树状分支的复杂多糖。通过比较 F、FD1、FS1和FS11的化学组成、单糖组成、分子量分布、红外光谱和糖链构象，发现岩藻聚糖对损伤的HMVEC保护作用与其多糖含量、岩藻糖含量、硫酸基含量、单糖组成、相对分子质量有密切关联。本研究结果表明岩藻聚糖能够有效保护氧化型低密度脂蛋白损伤的HMVEC，且纯度最高的组分FS11在浓度为500 μg/mL时，保护作用最强。

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Structural Identification of. Agardh Fucoidan and Its Protective Effect on HMVEC Damage Induced by Oxidized Low Density Lipoprotein

LIN Pei-chun1,2, CHEN Su-hua2,3, WANG Wei-min2, LIU Hai-yun2, HUANG Dan-si2, YANG Zhi-qiang2

（1.，524088，；2.,,524088,; 3.,518108,）

【】To investigate the structure of four fucoidans fromC. Agardhand its protective effect on oxidized low-density lipoprotein-induced HMVEC damage.【】UsingC. Agardh fucoidan (FD1) as raw material, FD1 was subjected to Sepharose Cl-6B agarose gel column chromatography to obtain the component FS11. Chemical composition and monosaccharide analysis of FS11 were performed. Four fucoidans（i.e. F, FD1, FS1，FS11）were implemented by molecular weight determination, sugar chain conformation and infrared spectroscopy. The MTT method was used to determine the effect of three fucoidan treatments of HMVEC on cell viability and to study the protective effect of 4 fucoidans on oxidized low density lipoprotein-induced HMVEC damage. 【】FS11 had the highest sulfate and polysaccharide contents as compared with F, F, FD1. In the monosaccharide composition of FS11, the fucose content is as high as 52.7%. The estimated molecular weight of F, FD1, FS1, and FS11 are 474 576, 459 032, 201 285, and 190 049, respectively. Fucoidans have complex dendritic branches and multiple spiral structures as confirmed by I-KI UV scanning and Congo red experiment. Infrared spectroscopy results show that each component has O—H, C—H polysaccharide characteristic functional groups, S==O active characteristic functional groups. After 24 hours of treatment, the four components (i.e. F, FD1, FS1, FS11) at a concentration of 500 μg/mL and 1 000 μg/mL can significantly reduce the proliferation inhibition of HMVEC damaged by oxidized low-density lipoprotein (< 0.01).【】C. Agardh fucoidan has a protective effect on HMVEC damage induced by oxidized low density lipoprotein.

C. Agardhfucoidan; structure identification; induced damage; HMVEC

TS254.1

A

1673-9159（2020）05-0072-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.009

2020-05-08

广东省自然科学基金项目（编号：2018A0303130020）; 国家级广东海洋大学大学生创新创业训练计划项目（CXXL2018005）

林沛纯（1997－），女，硕士研究生。E-mail：pclin1997@163.com

谌素华（1973－），女，高级实验师，主要从事食品科学的研究。E-mail：cshh1111@126.com

林沛纯，谌素华，王维民，等. 亨氏马尾藻岩藻聚糖结构鉴定及其对氧化型低密度脂蛋白诱导HMVEC损伤的保护作用[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（5）：72-80.

（责任编辑：刘朏）