华贵栉孔扇贝酶法制备α-葡萄糖苷酶抑制肽工艺优化

林海生，廖 津，章超桦，秦小明，曹文红，高加龙，罗凯耀

华贵栉孔扇贝酶法制备-葡萄糖苷酶抑制肽工艺优化

林海生1,2,3，廖 津1，章超桦1,2,3，秦小明1,2,3，曹文红1,2,3，高加龙1,2,3，罗凯耀1

（1. 广东海洋大学食品科技学院//国家贝类加工技术研发分中心（湛江）//广东省水产品加工与安全重点实验室//广东省海洋生物制品工程实验室//水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088；2. 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518108；3. 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心（大连工业大学），辽宁 大连 116034）

【】为了进一步挖掘海洋贝类潜在的降血糖功能。选用华贵栉孔扇贝闭壳肌为原料，以抑制-葡萄糖苷酶活性为评价指标，采用正交试验法和响应面分析法优化-葡萄糖苷酶抑制肽的制备工艺。华贵栉孔扇贝（）、马氏珠母贝（）和栉江珧（）等三种海洋贝类的闭壳肌酶解产物均对-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和脂肪酶具有抑制活性；正交试验和响应面综合分析结果表明，华贵栉孔扇贝闭壳肌制备-葡萄糖苷酶抑制肽的最佳工艺：复合蛋白酶酶添加量5 500 U/g，酶解温度57 ℃，酶解pH = 7，酶解时间4 h，其酶解液中小肽含量21.64 mg/mL，-葡萄糖苷酶的抑制率达到31.53%。利用响应面法可优化制备-葡萄糖苷酶抑制肽的工艺。

酶解；生物活性肽；-葡萄糖苷酶抑制率；响应面法

糖尿病是危害人类健康的重大疾病之一[1]，相关数据显示，2017年全球糖尿病患者已超4.2亿，预测2045年全球患病人数将突破6.9亿大关[2]，其中Ⅱ型糖尿病人数约占糖尿病患者总人数的90%，其主要发病机制特征为胰岛素抵抗、胰岛分泌缺陷[3]。通过抑制-葡萄糖苷酶的活性可以有效地降低餐后高血糖的发生，在临床上-葡萄糖苷酶抑制剂是常见的一线药物，如阿卡波糖和伏格列波糖等。但传统药物普遍价格昂贵，往往有副作用，并且容易产生耐药性，严重的还会损伤肝肾[4-5]。因而，寻找新型、副作用少、经济的天然降血糖物质成为该领域的研究热点[6-7]。

生物活性肽具有多种生物学功能，可以与机体内相关调节酶的作用位点相互作用，产生抑制效果，如抑制-葡萄糖苷酶、-淀粉酶、血管紧张素转换酶、抑制二肽基肽酶IV等，从而发挥其降血糖、降血压等功能[8-10]。因而，生物活性肽备受科学工作者的广泛关注[11]。选用食品优质蛋白质源和恰当蛋白酶，结合可控酶解技术，能够制备具有特殊生理活性的肽段。目前已经报道的具有降血糖活性的植物蛋白来源的水解肽主要有银杏多肽[12]、麦胚降血糖肽[13]、花生蛋白肽[14]、大豆/绿豆降血糖肽[15]、玉米降血糖肽[16]、糙米肽[17]等；而动物蛋白来源的水解肽主要有马鹿茸降血糖肽[3]、蚕蛹蛋白肽等[18]。近年来，随着水产蛋白高值化利用研究的开展，水产蛋白酶解物被发现是一种潜在的可用于开发降血糖功能食品的原料，如条斑紫菜蛋白肽[19]、南极磷虾酶解物[20]、贝类酶解物[21-23]等。

华贵栉孔扇贝（），俗称红贝、干贝蛤，一种热带或亚热带暖水性贝类，主产于日本、韩国、中国大陆、台湾沿海等地。我国主要养殖产地集中在广东、广西和海南等地。2019年渔业统计年鉴公布的数据显示，广东省扇贝海水养殖产量为113 511 t，而华贵栉孔扇贝是贝类养殖中的一个重要品种，养殖产量极大。扇贝闭壳肌是主要的可食用部分，目前除了鲜食外，主要用于加工成干贝、即食贝柱、速冻贝柱、扇贝柱罐头[24]等方便食品，精深加工利用程度较低。目前，尚未报道其在降血糖领域的应用。

为了进一步挖掘海洋贝类潜在的降血糖功能，本研究主要选用华贵栉孔扇贝闭壳肌为原料，以抑制-葡萄糖苷酶活性为主要评价指标，采用正交试验法和响应面分析法进一步优化酶解工艺。以期为扇贝资源高值化利用提供新思路，同时也为其在降血糖功能的深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

华贵栉孔扇贝（）、马氏珠母贝（），采自雷州市流沙湾养殖场；栉江珧（）购于湛江市东风市场。

复合蛋白酶（62 784 U/g），诺维信（中国）生物技术有限公司；-葡萄糖苷酶、对硝基苯基---吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl---glucopyranoside，pNPG）、4-硝基苯丁酸酯（p-Nitrophenyl butyrate，pNPB），上海源叶生物科技有限公司；-淀粉酶、脂肪酶，美国Sigma公司；可溶性淀粉、3,5-二硝基水杨酸（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS），广东光华科技股份有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris），北京亚米生物科技有限公司；Folin-酚蛋白定量试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术公司；盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UNIVERSAL 320R台式高速冷冻离心机，德国Hettich科学仪器公司；VARIOSKAN FLASH全波长扫描式多功能酶标仪，赛默飞世尔科技公司；SHZ-B水浴恒温振荡器，上海博讯医疗仪器股份有限公司；HHS数显式电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PHS-2F pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 贝类酶解液制备 鲜活贝类洗净开壳，分别取其外套膜和闭壳肌，100 ℃沸水漂烫1~2 min后沥干，取相同质量的贝组织，按照质量（g）∶体积（mL）= 1∶3的比例加入蒸馏水，均浆，调节pH = 7，按照酶添加量[E/S]为3 000 U/g加入蛋白酶，于50 ℃水浴恒温振荡器（100 r/min）中酶解4 h，100 ℃水浴灭酶，8 000 r/min条件下，离心10 min，取上清液，分别得到华贵栉孔扇贝闭壳肌酶解物（EHCh-am）和外套膜酶解物（EHCh-m）、马氏珠母贝闭壳肌酶解物（EHPf-am）和外套膜酶解物（EHPf-m）及栉江珧闭壳肌酶解物（EHAp-am）和外套膜酶解物（EHAp-m），分别测定其对-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和脂肪酶的抑制活性。

1.3.2-葡萄糖苷酶抑制率的测定 采用pNPG法测定-葡萄糖苷酶抑制活性，参考Zhang等[25]的方法稍作修改。移取110 μL磷酸盐缓冲液（PB，0.1 mmol/L；pH = 6.8）于96孔板微孔，分别加入20 μL样品溶液和20 μL-葡萄糖苷酶溶液（2.5 U/mL），混匀后于37 ℃孵育10 min后，加入20 μL 底物pNPG（1.25 mmol/L），体系于37 ℃反应20 min后，加入80 μL碳酸钠（0.1 mol/L）终止反应。采用酶标仪在405 nm处测定其吸光值，实验设置样品组、样品空白组、对照组、空白组，并按式（1）计算-葡萄糖苷酶抑制率：

抑制率（%）＝1－（样品－样品空白）/（对照－空白）， （1）

式中，样品：样品组吸光度值，样品+酶+ pNPG；样品空白：样品空白组吸光度值，样品+ PB + pNPG；对照：对照组吸光度值，PB + 酶+ pNPG；空白：空白组吸光度值，PB + pNPG。

1.3.3-淀粉酶抑制率的测定-淀粉酶的抑制活性采用DNS比色法，参考王斯慧等[26]的方法略作修改。1.5 mL离心管中，加入50 μL样液和50 μL 淀粉酶溶液（0.1 U/mL），37 ℃水浴20 min，加入100 μL可溶性淀粉（体积分数为0.5%），37 ℃环境中反应3 min后，90 ℃水浴1 min，加入100 μL DNS保持90 ℃水浴中继续反应10 min，冰浴冷却后加入900 μL蒸馏水，混匀后取200 μL在96孔板检测其在540 nm处吸光值，实验设置样品组、样品空白组、对照组、空白组，并根据式（2）计算-淀粉酶抑制率：

抑制率（%）＝1－（样品－样品空白）/（对照－空白）， （2）

式中，样品：样品组吸光度值，样品+ 酶+ 淀粉+ DNS；样品空白：样品空白组吸光度值，样品+ 蒸馏水+ 淀粉+ DNS；对照：对照组吸光度值，蒸馏水+ 酶+ 淀粉+ DNS；空白：空白组吸光度值，蒸馏水+ 淀粉+ DNS。

1.3.4 脂肪酶抑制率的测定 参考王雪等[27]方法稍加改进，分别取样品溶液50 μL和50 μL脂肪酶溶液（25 U/mL）于96孔板中混匀后，于37 ℃环境中孵育10 min，再加入1 mg/mL 4-硝基苯丁脂酸溶液，混匀后继续反应20 min，采用酶标仪在405 nm处测定其吸光度值，实验设置样品组、样品空白组、对照组、空白组，根据式（3）计算脂肪酶抑制率：

抑制率（%）＝1－（样品－样品空白）/（对照－空白）， （3）

式中，样品：样品组吸光度值，样品+ 酶+ pNPB；样品空白：样品空白组吸光度值，样品+ 蒸馏水+ pNPB；对照：对照组吸光度值，蒸馏水+ 酶+ pNPB；空白：空白组吸光度值，蒸馏水+ pNPB。

1.3.5 单因素试验及正交试验 以华贵栉孔扇贝闭壳肌作为研究对象，参照1.3.1所述酶解方法，分别考察酶解时间（0 ~ 6 h，酶添加量3 000 U/g、温度50 ℃，pH = 7）、酶解温度（45 ~ 65 ℃，酶添加量3 000 U/g，pH = 7，酶解时间4 h）、酶解pH值（pH = 6 ~ 8，酶添加量3 000 U/g，55 ℃，酶解时间4 h）和酶添加量（酶添加量2 000 ~ 6 000 U/g，pH = 7，55 ℃，酶解时间4 h）四个因素对酶解液中小肽含量和-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。

基于单因素试验结果，实验采用三水平三因素L9(33)正交试验，优化复合蛋白酶水解华贵栉孔扇贝闭壳肌的最佳工艺条件。

1.3.6 响应面试验设计 结合单因素和正交试验结果，使用Design-Expert 8.0.6 统计软件的Box-Behnken的实验设计方法，进行三因素三水平的响应面试验。以-葡萄糖苷酶抑制率为优化指标，确定最优工艺参数。

1.3.8 数据统计分析 使用Design-Expert 8.0.6 响应面优化软件进行数据优化分析[29]。根据方差结果进行显著性分析：> 0.05表示差异性不显著，< 0.05表示差异性显著，< 0.01表示差异性极显著。

2 结果与分析

2.1 不同贝类酶解产物对三种酶的抑制作用

选用合适蛋白酶能够将食品来源的蛋白质水解获得活性肽，不同蛋白酶酶解位点不同，酶解产物活性也具有差异[11]。三种海洋贝类复合酶酶解物对三种酶的抑制结果如图1所示，华贵栉孔扇贝、马氏珠母贝和栉江珧的外套膜和闭壳肌的酶解产物对-葡萄糖苷酶和-淀粉酶均具有较强的抑制活性。总体上看，闭壳肌酶解物的抑制活性高于外套膜酶解物。其中，华贵栉孔扇贝闭壳肌酶解物（EHCn-am）和栉江珧闭壳肌酶解物（EHAp-am）对-葡萄糖苷酶的抑制活性比马氏珠母贝酶解物（EHPf-am）强，而EHCn-am对-淀粉酶（51.07% ± 1.01%）和-葡萄糖苷酶（35.99% ± 1.97%）的抑制活性最强；另外，EHPf-am对脂肪酶表现出较强的抑制作用。

本研究是基于前期的实验基础上，采用经过加热前处理后的原料，选用的复合蛋白酶包含内切蛋白酶和外切肽酶，能从多肽链内部和末端水解肽键，释放出较多结构特异的肽段[28]。黄钦钦等[19]、胡春芹等[30]采用内切与外切蛋白酶的复合酶（中性蛋白酶、碱性蛋白酶、氨肽酶）酶解制备-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽；延海莹等[23]用复合蛋白酶酶解扇贝裙边制备活性肽具有降血糖功能；本研究结果与其具有一致性，可见，复合蛋白酶或复合酶解法适合制备降血糖肽。

使糖耐量恢复到正常水平是评价降糖药物疗效的一个重要方面，也是治疗糖尿病药物的主要机制之一[31]。-葡萄糖苷酶和-淀粉酶是糖代谢途径中的关键酶，调控碳水化合物降解为单糖的反应[19]。因此，通过抑制肠胃道的-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的活性，延缓人体内碳水化合物的吸收，维持餐后血糖降低到正常水平[23-26]。从图1可以看出，三种贝的酶解产物均对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶具有较强的抑制活性，是潜在开发降血糖功能食品的原料。通过对比发现，华贵栉孔扇贝闭壳肌作为酶解原料，经复合蛋白酶酶解得到的酶解液对a-葡萄糖苷酶抑制率效果突出，且对a-淀粉酶抑制率为最高。因此，选择华贵栉孔扇贝闭壳肌作为原料制备生物活性肽，并对其工艺进行优化。

EHCn-am：扇贝闭壳肌酶解物；EHCn-m：扇贝外套膜酶解物；EHPf-am：珍珠贝闭壳肌酶解物；EHPf-m：珍珠贝外套膜酶解物；EHAp-am：江珧贝闭壳肌酶解物；EHAp-m：江珧贝外套膜酶解物

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶解时间对酶解效果的影响 不同酶解时间对-葡萄糖苷酶抑制率和小肽含量如图2所示。酶解1 h后，酶解液中小肽含量迅速增加，同时酶解物对-葡萄糖苷酶抑制率也显著提升；随着酶解时间的增加，酶解液小肽含量和活性均相对增长较为缓慢，酶解3 ~ 4 h，活性不再增加，因而选用4 h进行下一步试验的酶解时间。

2.2.2 其他因素对酶解效果的影响 由图3可知，以酶解产物对-葡萄糖苷酶的抑制率作为评价指标，单因素试验中，最佳酶解pH = 7（图3A），酶解温度为55 ℃（图3B）；而随着加酶量的增加，酶解液对-葡萄糖苷酶抑制率也随之增高，但当加酶量达到5 000 U/g时，抑制率随着加酶量的增加没有显著的变化（图3C）。综上结果，采用三水平三因素L9(33)设计正交实验（表1）。

图2 酶解时间对酶解效果的影响

表1 正交实验设计及结果

2.3 正交实验结果

正交实验设计及方差分析结果分别如表1和表2所示。由表1的值分析结果可知，以-葡萄糖苷酶抑制率为指标的因素影响程度为：（加酶量）>（温度）>（pH），最佳组合为322。根据表2方差分析结果，加酶量为显著性因素，温度和pH均为非显著因素。最佳组合322（加酶量为5 000 U/g，温度为55 ℃，酶解pH = 7）的验证实验结果表明，该条件下酶解物的-葡萄糖苷酶抑制率达到29.51%，优于正交试验中的其他组合。

表2 正交实验方差分析结果

注:F(2, 2) = 19.00,F(2, 2) = 99.00; *,< 0.05

2.4 响应面实验设计结果

因在正交实验中，-葡萄糖苷酶抑制率随加酶量的增加呈明显增加，故根据单因素试验结果，设定各因素水平编码（表3），根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理[28]，设置15组试验，实验设计以及结果见表4。用Design-Expert 8.0.6对表中数据进行分析，得到-葡萄糖苷酶抑制率回归模型方程：= 28.86 + 2.71+ 0.76+ 0.14- 0.42- 0.08- 0.73- 0.792- 0.432- 0.732，方差分析见表5。

表3 响应面实验的因素和水平编码

表4 响应面实验设计与结果

表5 方差分析

注: *,< 0.05; **,< 0.01

由表5可看出，该模型< 0.05，表明该响应面模型是显著的，能较好拟合本次实验数据，说明试验误差小，可以用此模型对活性肽酶解工艺进行分析和预测。（加酶量）为极显著性因素，（温度）、和2均为显著性因素；而（pH）为非显著因素，对酶解液的-葡萄糖苷酶抑制活性影响不显著，三个因素对抑制活性影响的主次顺序为：（加酶量）>（温度）>（pH），与正交试验一致；交互作用的影响为>>。

图4 pH和加酶量的交互作用对a-葡萄糖苷酶抑制率影响

图5 温度和加酶量的交互作用对a-葡萄糖苷酶抑制率影响

图6 温度和pH的交互作用对a-葡萄糖苷酶抑制率影响

两因素间的交互效应分析结果如图4、图5和图6所示。响应曲面图可以直观反映出模型中任何两个因素交互作用对活性肽（-葡萄糖苷酶抑制率）的影响程度，曲线走势越陡，表明该因素影响越显著；曲线走势越平滑，则表明该因素影响较小[28]。由图4可知，3个响应面均为凸型曲面，其中，pH（）和温度（）响应面图曲面较陡（图6），说明两者之间交互作用对-葡萄糖苷酶抑制率的影响显著。

为了使-葡萄糖苷酶抑制率达到最大，通过软件分析，得到最佳酶解条件为：加酶量为5 500 U/g，酶解温度为57.26 ℃和pH = 6.96，-葡萄糖苷酶抑制率达30.85%。考虑到实际可行性的问题，将最佳酶解条件调整为加酶量5 500 U/g、酶解温度57 ℃和pH = 7，在此条件下进行验证实验，得到-葡萄糖苷酶抑制率为31.53%，与理论值基本一致。

3 结论

华贵栉孔扇贝、马氏珠母贝和栉江珧等三种海洋贝类的闭壳肌酶解产物均具有抑制-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和脂肪酶的活性；以抑制-葡萄糖苷酶活性为主要评价指标，通过单因素试验、正交试验和响应面综合分析，得到华贵栉孔扇贝闭壳肌制备-葡萄糖苷酶抑制肽的最佳工艺为：复合蛋白酶加酶量为5 500 U/g，酶解温度为57 ℃，酶解pH = 7，酶解时间4 h，其酶解液小肽含量为21.64 mg/mL，-葡萄糖苷酶的抑制率达到31.53%。本研究为华贵栉孔扇贝在降血糖功能的深入研究提供依据，同时也为资源高值化利用提供新思路。

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Optimization of Enzymatic Preparation of-Glucosidase Inhibitory Peptides from

LIN Hai-sheng1,2,3, LIAO Jin1, ZHANG Chao-hua1,2,3, QIN Xiao-ming1,2,3, CAO Wen-hong1,2,3, GAO Jia-long1,2,3, LUO Kai-yao1

（1.,(),,,,524088,; 2.,518108,; 3.(),116034,）

【】In order to further explore the potential antihyperglycemic substances from marine shellfish. 【】Based on-glucosidase inhibition rate, orthogonal design and response surface analysis method were used for optimization the preparation process of-glucosidase inhibitory peptides from adductor muscle of.【】All three adductor muscle hydrolysates, from,andpossessed inhibitory activity against-glucosidase,-amylase and lipase. The optimum technology conditions for preparation of-glucosidase inhibitory peptides were as follows: enzyme dosage (complex protease) of 5 500 U/g, temperature of 57 ℃, pH = 7, and hydrolysis time of 4 hours. Under this condition, the hydrolysate was with an oligopeptides concentration of 21.64 mg/mL and the-glucosidase inhibition rate was 31.53 %.【】Response surface methodology could be used for optimization the preparation of-glucosidase inhibitory peptides from the adductor muscle of.

enzymatic hydrolysis; bioactive peptide;-glucosidase inhibition rate; response surface methodology

TS254.9

A

1673-9159（2020）05-0097-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.012

2020-03-17

广东海洋大学博士启动项目(R17082)；广东海洋大学大学生创新创业训练项目（CXXL2019160）；国家贝类产业技术体系建设专项（CARS-49）；广东普通高等学校水产品高值化加工与利用创新团队项目（GDOU2016030503）；广东海洋大学创新强校工程重大科研成果培育计划（GDOU2017052606）

林海生（1985－），男，博士，讲师，研究方向为水产品加工、海洋活性物质开发。E-mail: haishenglin@163.com

林海生，廖津，章超桦，等. 华贵栉孔扇贝酶法制备α-葡萄糖苷酶抑制肽的工艺优化[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（5）：97-104.