尼罗罗非鱼Galectin-4基因的原核表达及诱导条件优化

张志强，刘鑫潮，牛金中，黄 瑜，王 蓓，简纪常

尼罗罗非鱼基因的原核表达及诱导条件优化

张志强，刘鑫潮，牛金中，黄 瑜，王 蓓，简纪常

（广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 // 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088）

【】研究尼罗罗非鱼（）基因（记作）的原核表达，为大量获取尼罗罗非鱼Galectin-4蛋白（OnGal-4）和后续功能研究奠定基础。根据NCBI上公布的尼罗罗非鱼基因序列（Genbank：XM-019345120）设计引物，构建原核表达载体，诱导Galectin-4重组蛋白（rOnGal-4）在BL21原核表达系统中表达，并优化其诱导条件。成功扩增出基因，并构建原核表达载体pGEX-4T-OnGal-4。rOnGal-4最佳诱导条件是温度28 ℃，IPTG浓度0.4 mmol/L，诱导时间4 h。在此条件下，rOnGal-4在可溶性蛋白中大量表达。Western-blot结果显示，rOnGal-4可与抗GST标签的单克隆抗体发生特异性反应。

尼罗罗非鱼；Galectin-4；基因克隆；原核表达；条件优化

尼罗罗非鱼（）是一种重要的世界性经济鱼类，在我国南方广泛养殖[1-2]。无乳链球菌（）为罗非鱼病原体之一，常会引起罗非鱼患病死亡，近年来给我国和世界罗非鱼养殖造成巨大的经济损失[3-4]。为有效控制疾病的发生与传播，了解与深入研究罗非鱼自身免疫系统尤为重要。

半乳糖凝集素（Galectin）是一类能与β-半乳糖苷特异结合的蛋白质，有调节细胞-细胞相互作用、细胞-基质黏附和跨膜信号转导等多种生理功能[5]，可识别微生物的非自身多糖，被认为是模式识别受体(Pattern Recognition Receptor)，可调节病原体相关分子模式(Pathogen-AssociatedMolecular Pattern) 激活的天然免疫过程[6]。迄今已鉴定出15种哺乳动物Galectin[7]，其中Galectin-4有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡以及通过稳定黏附连接复合物而促进细胞黏附等功能[8]，还可通过单核细胞的激活和分化发挥免疫调节功能[9]，在病原体识别、T细胞凋亡和NK细胞活化中发挥重要作用[10-11]。Galectin-4基因已在人类和小鼠中有相关研究[12-13]，但有关硬骨鱼类中Galectin-4基因的报道仅见于线鳢（）和大菱鲆（）[14-15]，Galectin-4在大菱鲆肠道中的表达水平最高，而在皮肤中的表达水平最低，另外，用鳗弧菌（）和海豚链球菌（）攻毒后，其表达量在肠道中显著下调[15]。表明Galectin-4在鱼类肠道抵抗感染的免疫反应中起着至关重要的作用，但目前对于Galectin-4在尼罗罗非鱼中的研究还未见报道。本研究通过克隆获得尼罗罗非鱼Galectin-4基因（）的开放阅读框（ORF）全长，构建原核表达载体pGEX-4T-OnGal-4，同时对诱导条件进行了优化，为大量获取尼罗罗非鱼Galectin-4重组蛋白（rOnGal-4）和研究该蛋白在尼罗罗非鱼免疫系统中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

罗非鱼购自广东省湛江市东风水产品市场。pMD18-T载体、rTaq酶、DNA Maker、T4连接酶、R I和I，TaKaRa公司。总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒，TRANS公司。彩虹Maker和GST标签蛋白纯化试剂盒，碧云天公司。质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒，Thermo Fisher公司。大肠杆菌DH5a和BL21感受态细胞采用超级感受态试剂盒制作。原核表达载体pGEX-4T（+）Vector由本实验室保存。引物合成与菌液测序由生工生物股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1基因的扩增 剖取尼罗罗非鱼的头肾，在无RNA酶的环境中提取尼罗罗非鱼的总RNA。将检测合格(琼脂糖凝胶电泳检测结果为条带单一) 的尼罗罗非鱼总RNA用反转录试剂盒按说明书将其反转录成cDNA模板。根据NCBI上预测的尼罗罗非鱼基因的ORF全长序列设计引物，引物序列为Gal4-R：CTTTG TTGCTCCTCCTGGC（R I）、Gal4-F：TAAGAA TAGAGAAGTGGATGTAGGAGAT（I）。以尼罗罗非鱼头肾的cDNA为模板，采用20 μL体系（Extaq Mix 10 μL、灭菌水7.5 μL、Gal4-R 1 μL、Gal4-F 1 μL、cDNA 0.5 μL）进行PCR反应扩增，扩增条件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 70 s，循环36次；72 ℃下终延伸10 min。扩增得到目的条带后，用pMD18-T载体与纯化回收产物在16 ℃连接30 min。取50 μL大肠杆菌DH5a感受态细胞，加入4 μL连接产物，混匀，冰浴20 min，42 ℃水浴锅中热激90 s，即刻置冰上冰浴2 min；加400 μL LB液体培养基，于37 ℃摇床振荡培养45 ~ 60 min；取50 ~100 μL涂在LA（带有Amp+的LB）琼脂培养板上，于37 ℃下倒置培养12 h。挑取单菌落用通用引物M13、RV进行菌落PCR鉴定，阳性菌落送去公司测序。

1.2.2基因原核表达载体的构建 对测序正确的菌液和pGEX-4T（+）空载菌种提取质粒，将质粒在37 ℃下双酶切30 min，纯化回收酶切后的目的片段。用T4连接酶将回收的目的片段与载体片段于4 ℃下连接10 h。将连接产物转入大肠杆菌DH5a感受态中，方法同1.2.1。采用pGEX4T(F)、pGEX4T(R) 进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆菌测序。对测序吻合的菌液提取质粒，并将提取的质粒转入大肠杆菌BL21感受态，用LA液体培养基在37 ℃摇床培育3 ~ 5 h。

1.2.3 rOnGal-4的诱导表达 待菌液的OD600值达到0.5时，取部分菌液在超净台用体积分数50%甘油保种，置于‒ 80 ℃冰箱保存，剩余部分用锥形瓶分装为两瓶。在其中一瓶中加入异丙基---硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1 mmol/L，另一瓶不加IPTG，两瓶菌液均置于18 ℃、120 r/min的摇床诱导9 h。收集诱导菌液和未诱导菌液各2 mL，以12 000 r/min离心，弃上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬3次，加入PBS重悬菌液50 μL，蛋白上样缓冲液10 μL，混匀。于100 ℃水中煮沸5 min，离心，取上清液（全菌蛋白）进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.4 rOnGal-4表达条件优化 在蛋白可成功表达的前提下，采取单一变量控制法对蛋白诱导表达条件进行逐一优化。比较rOnGal-4在IPTG浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，诱导时间分别为0、1、2、3、4、5、6、7 h，诱导温度分别为18、28、37℃下的表达情况，筛选出最佳诱导条件。

1.2.5 rOnGal-4的纯化及Western blot鉴定 最佳诱导条件下诱导rOnGal-4，然后收集诱导的菌液，进行超声破碎，在4℃、8 000 r/min条件下离心40 min，取上清液通过GST镍柱层析法纯化蛋白。取所得蛋白两份进行SDS-PAGE电泳，一份染色鉴定，同时将另一份用半干法转膜（5.5 mA 10 min）到PVDF膜上，于4 ℃下用含有50 mg/mL脱脂奶粉的TBST封闭10 h。先用鼠抗GST多克隆抗体（1∶5 000稀释）室温条件下孵育2 h，再用HRP标记的羊抗鼠IgM（1∶5000稀释）以室温条件孵育1 h，用超敏快速Western blot检测试剂盒显色检测，拍照。

2 结果

2.1 OnGal-4基因的PCR扩增和鉴定

PCR扩增获得一1 194 bp的条带（图1），条带大小与目的片段的ORF全长相符。将扩增片段和pMD-18T载体相连，转化，涂板，挑菌，用通用引物M13和RV鉴定单菌落，得到一1 354 bp的条带（图1），表明该菌落为阳性克隆。将阳性克隆菌落送去测序，测序结果显示插入pMD-18T载体的片段与目的片段完全一致。

M1、M2，DL2000 DNA分子标准；1、2，引物Gal4-R、Gal4-F扩增产物；3、4、5，引物M13和RV扩增产物

M1 and M2, DNA molecular Marker DL2000; 1 and 2, PCR amplification products by using Gal4-R and Gal4-F primers; 3, 4 and 5, PCR amplification products by using M13 and RV primers

图1基因PCR扩增和鉴定

Fig. 1 Cloning and identification ofgene

2.2 重组质粒pGEX-4T-OnGal-4的酶切鉴定

重组质粒pGEX-4T-OnGal-4双酶切后，在1 194 bp处得一段酶切产物，该酶切产物与基因的分子大小相同，并在4 969 bp处发现与pGEX-4T空载大小一致的条带（图2）。对质粒测序后，结果显示成功插入该载体。

M1、M2，DL10000 DNA、DL2000 DNA 分子标准；1、2，重组质粒双酶切的产物

2.3 rOnGal-4原核表达鉴定

rOnGal-4的原核表达鉴定结果（图3）显示，rOnGal-4诱导后在68 ku处出现一明显条带，而未诱导的rOnGal-4在68 ku处并未出现明显条带，表明该蛋白诱导表达获得成功。同时诱导pGEX-4T空载发现GST标签蛋白大小为26 ku，因此，诱导的rOnGal-4大小为42 ku，与预测的目标蛋白大小相同。

M，蛋白分子标准；1、2，未诱导和诱导后的pGEX-4T；3、4，未诱导和诱导后的rOnGal-4

2.4 rOnGal-4表达条件优化

2.4.1 rOnGal-4诱导物浓度优化 诱导物IPTG浓度优化结果（图4）表明，rOnGal-4的表达量随IPTG浓度的升高呈现先增加再保持平稳最后下降的趋势，当IPTG浓度达到0.4 mmol/L时，rOnGal-4表达量达到最大。再增加IPTG浓度rOnGal-4表达量不会明显增加；但当其浓度达到1.2 mmol/L时，rOnGal-4表达量反而会减少。因此，确定其诱导物IPTG的最佳浓度是0.4 mmol/L。

M，蛋白分子标准；1，未诱导的rOnGal-4；2-7，IPTG诱导浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L

2.4.2 rOnGal-4诱导时间优化 诱导时间优化结果显示在IPTG浓度和诱导温度一定时，rOnGal-4表达量在一定范围内会随着诱导时间的延长而逐渐增加，但当诱导时间达到4 h后再延长时间其表达量无明显增加（图5），由此确定rOnGal-4的最佳诱导时间是4 h。

M，蛋白分子标准；1-8，诱导时间浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7 h

2.4.3 rOnGal-4诱导温度优化 图6表明，在IPTG浓度和诱导时间一定时，不同温度条件对rOnGal-4在可溶性蛋白及包涵体蛋白中的表达量均有一定影响。在28℃诱导时rOnGal-4的可溶性蛋白和包涵体蛋白表达量最高，在37 ℃诱导时其可溶性蛋白的表达量最低。同时对rOnGal-4可溶性表达分析发现，其在包涵体蛋白中的表达量较高，但是由于可溶性蛋白较易获得且不会对蛋白活性有较多的损伤，更有利于后续试验的开展，所以确定rOnGal-4最佳诱导温度是28 ℃。

M，蛋白分子标准；1、3、5，18、28、37 ℃诱导表达的可溶性蛋白；2、4、6，18、28、37 ℃诱导表达的包涵体蛋白

2.5 rOnGal-4纯化鉴定和western bolt鉴定

在上述优化得到的最佳诱导条件下诱导rOnGal-4。诱导过的rOnGal-4全菌蛋白、可溶性蛋白和纯化后rOnGal-4的SDS-PAGE检测结果（图7A）显示，在68 ku处均有条带且纯化后的rOnGal-4呈现单一条带，表明蛋白纯化成功。对纯化后的蛋白进行Western bolt验证，结果显示为单一条带（图7B）。

A, SDS-PAGE鉴定; B, Western bolt鉴定; M, 蛋白分子标准；1, 未诱导的rOnGal-4；2、3, 诱导后rOnGal-4的全菌蛋白、可溶性蛋白；4、5, 纯化后的rOnGal-4

A, identification by SDS-PAGE; B, identification by Western bolt;

M, Protein molecular Marker; 1, rOnGal-4 without inducing; 2 and 3, The whole and Soluble protein of rOnGal-4 after induction; 4 and 5, Purified rOnGal-4 protein

图7 纯化后rOnGal-4的鉴定

Fig. 7 Identification for the purified rOnGal-4

3 讨论

原核系统具有在短时间内获得大量的重组蛋白、简单而廉价的细菌细胞培养以及众所周知的转录和翻译机制，基因修饰的简便性和许多细菌突变体的可用性等优点，因而在研究中被广泛应用[17]。为获得大量的重组蛋白，本研究选用大肠杆菌原核表达系统，并选用目前调节T7启动子转录活性最有效的分子诱导剂IPTG作为诱导剂[18]。因原核表达效果会受诸多表达元件和外界条件的影响[19]，故对其诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度进行了优化。结果表明，在IPTG浓度为0.4 mmol/L时rOnGal-4表达量最大。罗氏沼虾雌激素相关受体() 基因[20]、哈维氏弧菌基因[21]等的原核表达条件优化结果显示，IPTG浓度应在0.1 ~ 0.8 mmol/L范围，与本研究结果一致。IPTG浓度为1.2 mmol/L时蛋白表达量会下降，是IPTG毒性导致高浓度时抑制蛋白的表达[22]所致。诱导4 h rOnGal-4表达量最大，这与尼罗罗非鱼补体3基因[23]和尼罗罗非鱼Galectin-3基因[24]的表达条件优化结果相似。在28 ℃诱导时，rOnGal-4可溶性蛋白含量最高，与尼罗罗非鱼NCCRP-1基因[25]和人β2微球蛋白[26]的结果一致。可能原因是在37 ℃时大肠杆菌处于最佳生长状态，合成蛋白的速度快，导致蛋白来不及折叠形成包涵体。用最佳表达条件下诱导，所得rOnGal-4可溶性蛋白可被成功表达和纯化。本研究可为后续大量获取该蛋白制作多克隆抗体和为后续该蛋白的功能研究奠定基础。

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Prokaryotic Expression and Optimization ofGene from Nile Tilapia ()

ZHANG Zhi-qiang, LIU xin-chao, NIU Jin-zhong, HUANG Yu, WANG Bei, JIAN Ji-chang

(////,524088,)

【】To study the optimization conditions for prokaryotic expression of the Nile tilapia ()gene , and perform functional studiesof Galectin-4.【】A pair of primers were designed based on the tilapiagene sequence (Genbank: XM-019345120), and to expression plasmid (pGEX-4T-OnGal-4) was produced. The Galectin-4 recombinant clone was induced to express rOnCal4 in BL21 cells and the expression conditions were optimized .【】Thegene was successfully amplified and the prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-OnGal-4 was constructed. The optimal induction conditions for rOnGal-4 production were 0.4 mmol/L of IPTG at 28 ℃ for 4 h. The rOnGal-4 protein was highly expressed under the optimized expression conditions. Western-blot results showed that the rOnGal-4 could specifically react with GST-tag monoclonal antibody.

;; gene clone; prokaryotic expression; condition optimization

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2020）05-0118-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.015

2020-03-05

国家自然科学基金青年基金项目（31702386）；广东省科技厅国际科技合作领域项目（2017A050501037）；广东省普通高校青年创新人才类项目（2018KQNCX105）

张志强（1997－），男，硕士研究生，研究方向为水生生物医学。E-mail:248798423@qq.com

简纪常（1964－），博士，教授，研究方向为水产经济动物病害防治。E-mail：jianjc@gdou.edu.cn

黄瑜（1986－），博士，讲师，研究方向为鱼类免疫学。E-mail: huangyu@gdou.edu.cn

张志强，刘鑫潮，牛金中，等. 尼罗罗非鱼Galectin-4基因的原核表达及诱导条件优化[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（5）：118-123.

（责任编辑：刘庆颖）