杨树桑黄的ITS特异性标记及生物学特性

陆娜，宋吉玲，袁卫东

(杭州市农业科学研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310024)

杨树桑黄(Sanghuangporusvaninii)，是一种生长在杨树上的药用真菌，俗称为杨黄，属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)[1-2]，是桑黄真菌属的一个种，桑黄真菌属是我国一类传统药用真菌，具有抗菌、抗氧化、增强免疫力等作用，民间多用桑黄类真菌水煎液来辅助防癌和抗癌治疗[3]，也有报道杨黄具有与传统桑树桑黄(Sanghuangporussanghuang)同样的抑制肿瘤的功效[1,4]。

杨黄(S.vaninii)和桑黄(S.sanghuang)的子实体外观形态差异不明显，仅凭子实体外观难以准确鉴定[5-6]。目前，杨黄(S.vaninii)作为已大面积投产的药用菌，其遗传多样性评价以及利用是其育种领域中一个重要的研究方向[7]。笔者曾对杨黄(S.vaninii)和桑黄(S.sanghuang)ITS进行测序，结果显示，二者的ITS1-5.8S-ITS2序列分别为814 bp和773 bp，碱基相差40 bp左右，很难利用通用引物对(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR扩增、普通电泳来进行准确辨别；对其ITS序列比对显示，二者的局部序列存在较大差异，因此，利用ITS特异引物，针对性地扩增ITS特异片段，有助于杨黄(S.vaninii)的分子辅助鉴定。本试验运用可辨别杨黄(S.vaninii)与桑黄(S.sanghuang)的分子特异性标记引物，对16株供试菌株进行快速辨别，为杨黄(S.vaninii)育种及生产提供便捷。通过对其生物学特性的研究，最终确定高产优质的杨黄(S.vaninii)品种，实现该资源的可持续开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及其来源

供试的16个菌株为杭州市农业科学研究院蔬菜研究所菌种站收集、保藏的杨黄、桑黄菌株(表1)。

表1 供试菌株的名称及来源

1.1.2 培养料配方

马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉13 g、水1 L。

1.1.3 主要试剂及引物

研究所用主要分子生物学试剂包括新型快速植物基因组DNA提取试剂(BioTeke，北京)、PCR扩增试剂2’PowerTaqPCR MasterMix(BioTeke，北京)。

1.2 方法

1.2.1 菌丝生长速度测定

利用PDA培养基，按常规平板培养基制作方法配制，每个菌株设5个重复，接种后置于25 ℃恒温培养。分别于接种后定期观察各菌株长势、颜色，测量菌落直径，计算菌丝生长速度，菌丝生长速度=菌落半径(mm)/生长天数(d)，菌丝生长势分为稀疏、较浓密、浓密，用新复极差法对试验结果进行差异显著性分析。

1.2.2 基因组DNA的提取及浓度测定

供试的16个菌株取待测菌丝体样品0.2 g，加液氮彻底磨碎，利用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(BioTeke，北京)的说明提取样品的基因组DNA，提取后的DNA测定浓度，并经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，于-20 ℃保存备用。

1.2.3 辨别杨黄(S.vaninii)与桑黄(S.sanghuang)的分子特异性标记引物及检测方法

提取的16个菌株基因组DNA为模板，辨别杨黄(S.vaninii)与桑黄(S.sanghuang)的分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，上游引物序列为5′-TGCGCATGTGCACGGCCTT-3′；下游引物序列为5′-AGGAGGTAACAACAACTCCTT-3′。PCR反应体系每20 μL组成如下：2×PowerTaqPCR Master Mix 10 μL(PR1700，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司)、10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL、20 ng·μL-1模板DNA 3 μL、ddH2O 5 μL。PCR反应条件如下：94 ℃预变性6 min；94 ℃变性40 s，54.8 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；最后于72 ℃补平7 min，终止温度为4 ℃，获得扩增产物。

取扩增产物5 μL，与1 μL 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5 V·cm-1电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现651 bp的DNA条带，则待测标本为杨黄(S.vaninii)，若电泳结果未出现651 bp的DNA条带，则待测标本为桑黄(S.sanghuang)。

2 结果与分析

2.1 鉴定性试验

按照杨黄分子特异性标记引物及检测方法，分别对16个样品菌株进行检测，电泳结果见图1，其中，编号为1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、的样品扩增出长度为651 bp的特殊DNA条带，而编号为9、10、11、13、14、15的样品未扩增出长度为651 bp的特殊DNA条带。说明供试样品中1～8、12及16号样品为杨黄，9、10、11、13、14、15为桑黄。

采用的Marker片段长度由上至下为2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp。图1 辨别设计特异引物的ITS-PCR扩增图谱

为了保证桑黄菌株鉴定的可靠性，采用通用型引物对桑黄6个菌株进行了重复试验，如图2所示，其中13号菌株在1 000 bp位置有一条带，其余品种均在1 000 bp以下，由于桑黄菌株在通用型引物下不会产生大于1 000 bp条带，故13号菌株非杨黄或桑黄菌株。

采用的Marker片段长度由上至下为2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp。图2 通用引物下ITS-PCR扩增图谱

2.2 杨黄菌丝生长速度测定

由表2可知，鉴定为杨黄的10个菌株在PDA培养基上菌丝平均生长速度最快的是5号菌株，达0.203 cm·d-1，其次是8号和12号菌株，分别为0.193 cm·d-1和0.187 cm·d-1，生长最慢的是6号菌株，仅为0.157 cm·d-1，方差分析表明，各菌株存在显著差异。从菌丝长势来看，2、5、8号等菌株菌丝长势最好，菌丝浓密度高，3、4、16号菌丝长势较弱。

表2 不同菌株菌丝的生长情况

2.3 各菌株产量比较

由表3可以看出，各参试菌株之间在产量方面存在显著差异，12号菌株产量最高，达13 490 g，单包平均产量达14.2 g·包-1；其次为8号菌株，产量达1 146.6 g，单包平均产量达12.6 g·包-1，其他菌株表现一般，特别是4号、6号品种，污染率高，产量低，单包平均产量仅为1.4和1.2 g·包-1。

表3 不同菌株出菇产量(干品)的比较

3 小结

ITS特异性标记引物可用于相似种间的分子识别，我们利用ITS特异性标记引物鉴定了浙江、武汉及福建等地采集到的16个菌株样品，结果表明，供试样品中1～8、12及16号菌株为杨黄(S.vaninii)，9、10、11、14、15号菌株为桑黄(S.sanghuang)，13号菌株非杨黄或桑黄菌株。通过10个杨黄(S.vaninii)菌株菌丝生长势、产量进行比较试验，各参试菌株之间在产量方面存在显著差异，12号菌株(S太)产量最高，单包平均产量达14.2 g·包-1，8号菌株(S14)表现其次，单包平均产量达12.6 g·包-1，其他菌株表现一般，4号、6号品种污染率高，产量低。说明S太和S14产量表现好，具有较好的推广价值。