低氧对小鼠脾脏淋巴细胞产生IL-17和IL-10的影响※

刘 珺,王烈宏,汪晓筠,胡 英,许玉珍,乔丽娟,李慧倩,永 胜*

(1.青海大学医学院,青海西宁810001;2.青海红十字医院妇产科,青海西宁810016)

炎症反应导致炎症组织中产生低氧微环境[1-3],而新的研究显示低氧暴露能导致机体炎症反应的发生,例如将SD大鼠暴露于低压低氧环境中能显著提高其胃肠道炎性细胞因子水平[4];将小鼠暴露于低氧环境中,小鼠体内多个器官中炎症细胞增多,血清中炎性细胞因子水平升高;将健康人暴露于低氧环境中,其血清中IL-6、IL-6R和C反应蛋白水平升高[5]。但目前关于低氧暴露如何导致机体产生炎症反应的机制尚未完全阐明,且目前直接将实验动物暴露于高原低氧环境中进行的科学研究不足。因此,本研究通过构建高原低氧动物模型,结合体外低氧培养细胞实验,研究低氧对小鼠脾脏淋巴细胞产生IL-17、IL-10的影响,初步探讨低氧暴露下机体产生炎症反应的调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

6～8周龄C57BL/6J小鼠购自西安交通大学医学部实验动物中心〔动物合格证号：SCXK(陕)2017-003〕。RPMI1640培养液购自Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自BI公司;青链霉素混合液、红细胞裂解液、0.4%台盼蓝染液和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)均购自北京索莱宝科技有限公司;豆蔻酰佛波醇乙酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和离子霉素购自Sigma公司;TRIzol购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒[PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)]、qPCR试剂盒[TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)]和引物均购自TaKaRa公司;小鼠白介素17ELISA试剂盒和小鼠白介素10ELISA试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 构建高原低氧动物模型

小鼠随机分为3组,每组50只。三组小鼠在相同室温(18℃～22℃)条件下分别于西安交通大学医学部实验动物中心(海拔400m,常氧组)、青海大学医学院实验动物中心(海拔2200m,低氧组1)和青海省果洛州玛多县医院(海拔4200m,低氧组2)饲养 1、7、14、21、28 d,每个时间点为一组,每组10只。

1.2.2 分离并培养小鼠脾脏淋巴细胞

将10只小鼠脱颈处死后浸泡于75%酒精中5min,转至生物安全柜内,无菌取出脾脏细胞,用红细胞裂解液裂解红细胞后,用含10%FBS和1%青链霉素混合液的RPMI1640培养液重悬细胞。取部分细胞悬液予以台盼蓝染色并在倒置显微镜下计数细胞并计算细胞存活率(细胞存活率≥95%)。调整细胞浓度至2.0×106个/mL,并将细胞悬液接种至24孔细胞培养板中,每孔加入500μL细胞悬液(细胞数量为1.0×106个/孔)。同一只小鼠脾脏组织分离得到的细胞分为两组,分别在 CO2细胞培养箱(37℃,5%CO2,21%O2,饱和湿度。即常氧组)和三气培养箱(37℃,5%CO2,1%O2,饱和湿度。即低氧组)中培养 2、24、48、72 h。

1.2.3 检测小鼠脾脏组织及脾脏淋巴细胞IL-17和IL-10 mRNA表达水平(RT-PCR法)

分离小鼠脾脏组织并立即放入液氮中保存,低温研磨组织,每100 mg组织中加入1 mL TRIzol提取总RNA,测定RNA浓度及质量,并逆转录为cDNA。以β-Actin为内参对照,以400m组为对照组,用RT-PCR法检测2200m组和4200m组IL-17和IL-10 mRNA表达水平(引物序列详见表1),反应条件：95℃预变性30 s;95℃变性5 s,63℃退火延伸60 s;循环60次终止反应。采用2-ΔΔCt法计算相关基因mRNA相对表达量。每个样设3个复孔。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequence of RT-PCR primers

取出培养箱中的细胞悬液离心(4℃,1500r/min)5min,收集细胞,每孔收集的细胞中加入1mL TRIzol提取总RNA,测定RNA浓度及质量,并逆转录为cDNA。以β-Actin为内参对照,以常氧组为对照组,用RT-PCR法检测低氧组IL-17和IL-10mRNA表达水平,反应条件：95℃预变性30 s;95℃变性5 s,63℃退火延伸60 s;循环60次终止反应。采用2-ΔΔCt法计算相关基因mRNA相对表达量。每个样设3个复孔。

1.2.4 检测小鼠脾脏淋巴细胞培养上清液中IL-17和IL-10的浓度(ELISA法)

检测前5 h,向培养的脾脏淋巴细胞中加入PMA(终浓度50ng/mL)和离子霉素(终浓度1μg/μL)继续培养。5 h后,取出培养箱中的细胞悬液离心(4℃,1500r/min)5 min,收集细胞培养上清液,采用小鼠白介素17ELISA试剂盒和小鼠白介素10ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中IL-17和IL-10的浓度,分别设空白孔、标准孔和待测样品孔,每个样设3个复孔。最后用酶标仪在450 nm波长处依序测量各孔的吸光度(OD值)。利用标准曲线计算出每个样品中细胞因子的浓度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 高原低氧环境对脾脏组织IL-17及IL-10 mRNA表达水平的影响

为探究高原低氧环境对小鼠脾脏组织IL-17及IL-10表达的影响,以β-Actin为内参对照,用RTPCR法检测并计算海拔2200m组和4200m组IL-17和IL-10的相对表达量。结果显示,以海拔400m组为对照组,2200m组暴露于低氧14 d时IL-17表达水平升高(P=0.046,表2),21 d时IL-17表达水平继续升高(P＜0.001,表2),28 d时IL-17表达水平降至400m组水平(P=0.990,表2);4200m组暴露于低氧7、14、21 和28 d时IL-17表达水平持续升高(P分别为 0.007、0.002、0.036、0.001,表 2),表明高原低氧环境刺激下小鼠脾脏组织IL-17表达水平升高,且随着海拔升高缺氧程度加重,IL-17表达水平升高程度更明显。海拔2200m组IL-17表达水平整体呈先上升后下降趋势,以1d组为对照组,14 d时IL-17表达水平升高(P=0.04,表2),21 d时IL-17表达水平持续升高(P＜0.001,表2),但在28 d时IL-17表达水平降至1d组水平(P=0.972,表2);而海拔4200m组IL-17表达水平整体呈上升趋势,以24 h组为对照组,14 d时IL-17表达水平升高,有统计学意义(P=0.03,表2),21 d时IL-17表达水平升高,但无统计学意义(P=0.356,表2),在28 d时IL-17表达水平继续升高,有统计学意义(P=0.031,表2)。

以海拔400m组为对照组,2200m组暴露于低氧 1、7、14、21 d时IL-10表达水平持续升高(P分别为＜0.001、＜0.001、0.024、＜0.001,表 3),但在28 d时IL-10表达水平降至400m组水平(P=0.093,表 3);4200m 组低氧暴露 1、7、14、21、28 d时,IL-10表达水平持续升高(P 分别为＜0.025、＜0.001、0.009、0.006、0.002,表3),表明在高原低氧环境刺激下小鼠脾脏组织IL-10表达水平升高,但随着海拔升高缺氧程度加重,尽管IL-10的升高持续时间延长,其升高程度却降低(表3)。海拔2200m组IL-10表达水平整体呈先上升后下降趋势,以1d组为对照组,7d时IL-10表达水平升高(P＜0.001,表3),14 d和21 d时IL-10表达水平降至1d组水平(P分别为0.953和 0.965,表3),28 d时IL-10表达水平降低(P=0.001,表3);海拔4200m组IL-10表达水平整体亦呈先上升后下降趋势,以1d组为对照组,7 d时,IL-10表达水平升高(P=0.002,表3),14、21 d和28 d时,IL-10表达水平降至24h组水平(P分别为 0.994、0.805、0.667,表 3)。

表2 高原低氧环境暴露小鼠脾脏组织中IL-17的相对表达量(n=10,±s)Table 2 IL-17 relative expression in spleen ofm ice exposed to high altitude hypoxic environment(n=10,±s)

表2 高原低氧环境暴露小鼠脾脏组织中IL-17的相对表达量(n=10,±s)Table 2 IL-17 relative expression in spleen ofm ice exposed to high altitude hypoxic environment(n=10,±s)

*：表示与400m组比较,P＜0.05;#：表示与1 d组比较,P＜0.05

Group 400m(fold change)2200m(fold change)4200m(fold change) F P 1 d 1.024±0.258 0.830±0.306 1.136±0.350 2.536 0.098 0.998±0.245 1.545±0.972 1.776±0.593* 3.532 0.043 14 d 0.988±0.313 1.645±0.681*# 1.881±0.576*# 7.185 0.003 7 d 1.009±0.243 1.915±0.398*# 1.594±0.583* 11.346 ＜0.001 28 d 0.979±0.322 0.946±0.217 1.743±0.443*# 17.565 ＜0.001 21 d 0.041 6.394 3.191 - -P 0.997 ＜0.001 0.022 - -F

表3 高原低氧环境暴露小鼠脾脏组织中IL-10的相对表达量(n=10,±s)Table 3 IL-10 relative expression in sp leen ofm ice exposed to high altitude hypoxic environment(n=10,±s)

表3 高原低氧环境暴露小鼠脾脏组织中IL-10的相对表达量(n=10,±s)Table 3 IL-10 relative expression in sp leen ofm ice exposed to high altitude hypoxic environment(n=10,±s)

*：表示与400m组比较,P＜0.05;#：表示与1 d组比较,P＜0.05

Group 400m(fold change)2200m(fold change)4200m(fold change) F P 1 d 1.019±0.206 1.814±0.268* 1.305±0.227* 29.293 ＜0.001 1.001±0.170 2.848±0.336*# 2.193±0.487*# 69.354 ＜0.001 14 d 1.021±0.235 2.187±1.102* 1.388±0.246* 8.021 0.002 7 d 0.989±0.305 1.712±0.175* 1.466±0.279* 20.081 ＜0.001 28 d 1.017±0.196 1.245±0.241# 1.499±0.300* 9.323 0.001 21 d 0.038 12.067 12.269 - -P 0.997 ＜0.001 ＜0.001 - -F

2.2 低氧对脾脏淋巴细胞IL-17及IL-10 mRNA表达水平的影响

为探究低氧对脾脏淋巴细胞IL-17及IL-10 mRNA表达的影响,以β-Actin为内参对照,以常氧组为对照组,用RT-PCR法检测低氧组脾脏淋巴细胞IL-17和IL-10 mRNA的相对表达量。结果显示,低氧刺激2 h时,两组间IL-17表达水平无显著性差异(P=0.566,表4);低氧刺激24 h时,低氧组IL-17表达水平显著升高(P＜0.001,表4);低氧刺激48 h时,低氧组IL-17表达水平亦显著升高(P=0.044,表4);低氧刺激72 h时,低氧组IL-17表达水平虽仍高于常氧组,但无统计学意义(P=0.691,表4);低氧组IL-17表达水平整体呈先上升后下降趋势,这些结果提示低氧可促进脾脏淋巴细胞IL-17基因表达上调。

低氧刺激2 h时,两组间IL-10表达水平无显著性差异(P=0.998,表5);低氧刺激24 h时,低氧组IL-10表达水平显著升高(P=0.001,表5);低氧刺激48 h时,低氧组IL-10表达水平亦显著升高(P=0.001,表5);但低氧刺激72 h时,低氧组IL-10表达水平低于常氧组(P=0.003,表5),低氧组IL-10表达水平整体呈先上升后下降趋势。这些结果提示低氧刺激早期促进脾脏淋巴细胞IL-10基因表达上调,但随着低氧刺激时间延长,低氧抑制脾脏淋巴细胞IL-10基因表达上调。

表4 低氧刺激下小鼠脾脏淋巴细胞中IL-17的相对表达量(n=10,±s)Table 4 IL-17 relative expression in murine splenic lym phocytes cultured in hypoxic environment(n=10,±s)

表4 低氧刺激下小鼠脾脏淋巴细胞中IL-17的相对表达量(n=10,±s)Table 4 IL-17 relative expression in murine splenic lym phocytes cultured in hypoxic environment(n=10,±s)

Group Normoxia(fold change)Hypoxia(fold change) t P 2 h 0.959±0.800 1.120±0.341 -0.584 0.566 1.022±0.223 8.545±0.109 -95.926 ＜0.001 48 h 2.046±2.004 5.243±4.068 -2.230 0.044 24 h 72 h 1.304±0.679 1.475±1.154 -0.405 0.691

表5 低氧刺激下小鼠脾脏淋巴细胞中IL-10的相对表达量(n=10,±s)Table 5 IL-10 relative expression in murine splenic lym phocytes cultured in hypoxic environment(n=10,±s)

Group Normoxia(fold change)Hypoxia(fold change) t P 2 h 1.017±0.145 1.017±0.279 -0.002 0.998 1.012±0.170 2.221±0.834 -4.494 0.001 48 h 1.022±0.229 1.580±0.392 -3.884 0.001 24 h 72 h 1.036±0.222 0.739±0.156 3.460 0.003

2.3 低氧对脾脏淋巴细胞分泌IL-17及IL-10的影响

为探究低氧对脾脏淋巴细胞分泌IL-17及IL-10的影响,以常氧组为对照组,用ELISA法检测低氧组脾脏淋巴细胞培养上清液中IL-17和IL-10的浓度。结果显示,尽管整体呈下降趋势,但低氧刺激24 h(P=0.042,表 6)、48 h(P＜0.001,表 6)、72 h(P=0.030,表6)时IL-17浓度始终高于常氧组,表明低氧促进脾脏淋巴细胞分泌IL-17。而低氧组IL-10浓度仅在低氧刺激24 h时高于常氧组(P=0.024,表7),低氧刺激48 h时,降至常氧组水平(P=0.881,表7),低氧刺激72 h时,则低于常氧组(P=0.015,表7),整体呈下降趋势。这些结果提示低氧刺激早期促进脾脏淋巴细胞分泌IL-10,但随着低氧刺激时间延长,低氧抑制脾脏淋巴细胞分泌IL-10。

表6 低氧刺激下小鼠脾脏淋巴细胞培养上清液中的IL-17含量(n=10,±s)Table 6 Il-17 contents in supernatant ofmurine splenic lym phocytes cultured in hypoxic environment(n=10,±s)

表6 低氧刺激下小鼠脾脏淋巴细胞培养上清液中的IL-17含量(n=10,±s)Table 6 Il-17 contents in supernatant ofmurine splenic lym phocytes cultured in hypoxic environment(n=10,±s)

Group Normoxia(pg/mL)Hypoxia(pg/mL) t P 24 h 42.791±2.497 45.244±2.521 -2.186 0.042 28.448±1.716 31.487±1.314 -4.446 ＜0.001 72 h 22.323±2.651 25.091±2.584 -2.364 0.030 48 h

表7 低氧刺激下小鼠脾脏淋巴细胞培养上清液中的IL-10含量(n=10,±s)Table 7 Il-10 contents in supernatant ofmurine sp lenic lym phocytes cu ltured in hypoxic environment(n=10,±s)

表7 低氧刺激下小鼠脾脏淋巴细胞培养上清液中的IL-10含量(n=10,±s)Table 7 Il-10 contents in supernatant ofmurine sp lenic lym phocytes cu ltured in hypoxic environment(n=10,±s)

Group Normoxia(pg/mL)Hypoxia(pg/mL) t P 24 h 31.835±1.516 33.916±2.189 -2.472 0.024 48 h 23.705±0.552 23.548±3.183 0.154 0.881 72 h 23.937±3.044 21.160±1.229 2.675 0.015

3 讨论

IL-17,主要由Th17细胞分泌,是机体重要的促炎细胞因子[6],而IL-10主要由Treg细胞分泌,是机体重要的抗炎细胞因子[7],二者共同调控机体免疫反应和炎症反应的平衡。我们的研究结果显示,高原低氧环境能够促进机体脾脏组织IL-17表达水平升高;促进脾脏组织IL-10表达水平升高,但超过一定海拔高度后,其促进作用减弱,提示轻度缺氧促进IL-10表达,而重度缺氧则可能对IL-10的表达具有双重作用,即除具有促进IL-10表达的作用外,亦具有抑制IL-10表达的作用。这些结果表明高原低氧暴露促进脾脏组织IL-17表达,同时对IL-10的表达具有促进和抑制的双重作用,提示高原低氧暴露可能通过调控机体IL-17/IL-10平衡,影响其对机体免疫系统的调节作用,进而参与低氧暴露下机体炎症反应的发生过程。

进一步进行细胞实验,实验结果显示低氧刺激能够促进脾脏淋巴细胞的IL-17基因表达,而低氧刺激早期促进脾脏淋巴细胞的IL-10基因表达,但随着低氧刺激时间延长,低氧抑制脾脏淋巴细胞的IL-10基因表达。用ELISA法检测脾脏淋巴细胞培养上清液中IL-17及IL-10浓度的结果提示,低氧刺激很有可能通过促进机体产生IL-17,同时抑制机体产生IL-10参与机体炎症反应的发生。

低氧刺激下,机体产生低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α),与细胞内组成性表达的HIF-1β聚合形成HIF-1,调控细胞在低氧刺激下的功能及代谢转变[8,9]。HIF-1通过上调Th17细胞特异的转录因子维甲酸受体相关孤儿核受体 γt(retinoic acid receptor related orphan nuclear receptorγt,RORγt)的表达,促进 Th0细胞向 Th17细胞分化,分化成熟的Th17细胞分泌IL-17、IL-21和IL-22等多种促炎细胞因子[9,10],机体内的IL-17主要由Th17细胞产生[11,12],这就将低氧刺激与IL-17水平的升高联系了起来。我们的实验结果亦显示低氧暴露小鼠脾脏组织中IL-17的表达水平升高,体外低氧培养小鼠脾脏淋巴细胞的IL-17表达水平升高且其分泌IL-17能力增强。而IL-10主要由Treg细胞产生,在机体内发挥抗炎作用[13]。HIF-1介导Treg细胞特异的转录因子叉头蛋白3(forkhead box P3,FOXP3)通过泛素-蛋白酶体途径降解,进而抑制Th0细胞向Treg细胞分化,降低IL-10水平[10,14],但同时HIF-1亦被报道上调Treg细胞FOXP3中的基因表达,上调FOXP3蛋白水平,这在维持已经分化成熟的Treg细胞功能中发挥重要作用,例如HIF-1缺陷的Treg细胞不能在自身免疫性结肠炎中发挥保护性作用[14]。我们的实验结果显示,高原低氧暴露组小鼠脾脏组织中的IL-10表达整体呈先上升后下降趋势;体外低氧培养脾脏淋巴细胞实验显示,随着低氧培养时间延长,小鼠脾脏淋巴细胞IL-10表达水平先升高后下降,且其分泌IL-10水平亦先升高后下降。这可能是由于在低氧刺激初期,HIF-1上调机体中现有的分化成熟的Treg细胞中的FOXP3基因表达,上调FOXP3蛋白以维持Treg细胞的正常功能,促进其分泌IL-10;而低氧刺激长时间存在时,HIF-1通过降低FOXP3蛋白水平,抑制Th0向Treg细胞分化,此时由于具有功能的Treg细胞逐渐凋亡,又没有新生的Treg细胞补充,导致机体总Treg数量减少、机体IL-10水平降低。

IL-17促进多种炎性细胞因子及趋化因子表达,具有强大的促炎作用[15],在病理情况下,机体产生过多的IL-17会导致炎症反应过强,进而造成组织损伤[16]。IL-10通过抑制免疫细胞分泌炎性细胞因子、降低APC的抗原提呈能力和抑制免疫细胞增殖发挥抗炎作用[17,18],在病理情况下,IL-10分泌减少使机体免疫反应过强,进而导致组织损伤及病理情况的发生[19-22]。IL-17和IL-10共同在调节机体免疫反应和炎症反应平衡中发挥重要作用。研究显示低氧暴露能导致机体炎症反应的发生[10,23],但目前关于低氧如何导致机体产生炎症反应尚未完全阐明,我们的研究结果显示低氧促进机体淋巴细胞分泌IL-17,同时抑制其分泌IL-10。低氧刺激下IL-17/IL-10平衡向IL-17偏移,这很有可能是低氧暴露导致机体产生炎症的机制之一。