青海藏区发酵乳对阿尔茨海默病模型小鼠认知功能的影响※

刘军莉,刘川川,李润乐,刘慧慧,崔 森*

(1.青海大学附属医院,青海西宁810001;2.青海大学医学院,青海 西宁810001)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种获得性、进行性认知损害足以影响日常生活能力的神经退行性病变,是导致痴呆的最主要的原因,占50%～75%[1]。AD的基本特征是淀粉样斑块(Aβ)和神经纤维缠结(NFTs)[2],此外可见营养不良的神经突起、星形胶质细胞增生及小胶质细胞的活化等[3]。近年来,虽然研究者们对AD的理解有了很大的提高,但具体机制仍无法完全阐明。普遍认为,Aβ沉积引起神经炎症,导致神经元损伤,从而引发AD。由于AD起病缓慢、病程长、病因复杂,目前仍无确切的治疗药物和方法。有研究显示,食用发酵乳制品,如酸奶和低脂奶酪,可能会降低老年人认知能力下降的风险,并有助于预防AD[4-6]。藏区酸奶是由青海藏区农牧民沿用传统方法手工制作的发酵食品,通常以鲜牛奶为原料,用天然乳酸菌作发酵剂,在37℃左右条件下发酵8～10 h。已有研究表明藏区牦牛酸奶具有抗氧化活性、降低胆固醇以及提高免疫力的作用[7]。在青藏高原,发酵乳是藏族人日常饮食的重要组成部分[8]。我们推测藏族人群AD患病率低除了与遗传背景、生活习俗等有关以外,可能与长期进食传统手工发酵乳有关。本研究观察长期给予藏区发酵乳对阿尔茨海默病模型小鼠认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

两月龄SPF级雄性B6C3系APP/PS1双转基因小鼠,体重(20.03±3.52)g;两月龄SPF级雄性B6C3系野生型小鼠,体重(19.86±3.37)g,均购于江苏集箤药康生物有限公司[许可证号：SCXK(苏)2018-0008]。置于SPF级动物房中单笼饲养,自由摄食(水)。本实验操作严格按照国家《实验动物管理条例(GB14923-2010)》执行。所有动物实验经青海大学动物保护与研究伦理委员会审核和批准。

1.1.2 菌种与发酵乳

L.helveticus(CCTCC AB 2010205)购自中国微生物保藏管理中心。藏区发酵乳样品来自青海省海南藏族自治州(海拔3200米)手工制作发酵乳的牧民家庭。用无菌吸管分多次吸取60～100 mL样品装入无菌的玻璃瓶中并以塑料薄膜密封,用低温储藏箱带回实验室,使用20%甘油保存于-80℃冰箱中备用。

1.1.3 主要仪器和试剂

MRS购自北京索莱宝科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物工程有限公司;免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司;Aβ、TLR4、Myd88、NF-κBp65 蛋白抗体均购自英国艾博抗公司;Aβ1-42酶联免疫吸附试剂盒购自武汉伊莱特生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 藏区发酵乳制备

在无菌条件下,按照传统发酵流程标化发酵过程：将牛奶煮沸5 min灭菌,冷却至37℃,与样品(发酵前的酸奶)混合,搅拌均匀,快速发酵。整个过程持续12 h,其间温度维持在42℃。

1.2.2 菌落数计算

发酵完成后将发酵乳接种在MRS培养基中,在37℃厌氧培养箱倒置48 h,采用平板菌落计数法计数[14]：取发酵乳样品(0.5mL)放入0.85%生理盐水中,摇匀拌匀。充分混匀后制成1：100的稀释液,如此递增直至稀释到1：10-7。分别吸取三个稀释度(10-5,10-6,10-7)的样品稀释液1 mL于MRS琼脂培养平皿内均匀涂布,每个稀释度做两个平行平皿,同时做PBS缓冲液的空白对照。在37℃厌氧培养箱倒置培养48 h。选择符合益生菌菌落特征、菌落数在40～300之间的平板按照GB/T 4789.35-2003规范要求计数菌落。

1.2.3 分组与干预

将APP/PS1转基因小鼠随机分为三组：(1)转基因模型对照组(APP/PS1组;n=12;不进行饮食干预,给予生理盐水);(2)乳酸杆菌组〔Lac.组;n=12;用瑞士乳杆菌(L.helveticus,Lac.)灌胃〕;(3)藏区发酵乳组(Yogurt组;n=12;用藏区发酵乳灌胃)。野生组(WT组;n=12;用生理盐水灌胃)。L.helveticus及藏区发酵乳灌胃剂量根据以往的文献[9-11]设定。这些文献结果显示,补充益生菌,剂量为10mL/kg/d时可以改善小鼠的记忆。此外,为了确保各组干预小鼠获得活菌,我们每天上午9点通过灌胃进行饮食干预,持续20 w。

1.2.4 水迷宫实验(MWM)

在灌胃20 w后,使用水迷宫实验(包括定位航行和空间探索)评估各组小鼠的学习和记忆能力[12]。实验使用圆形不透明水池〔直径130cm;高度30cm,水温(21±1)℃〕,水池等分4个象限,圆形平台(直径6cm)置于象限中央(隐藏在水面下1cm处)。从4个象限中点面向池壁将小鼠放入水中训练1～3 d,测试时设定第III象限为目标象限,每次训练60 s,若60 s未找到平台,将小鼠引导至第III象限平台站立15 s,记录潜伏期为60 s;第四天撤去平台将小鼠从第III象限放入水池,记录其60 s内在目标象限停留的时间及穿越平台的次数。

1.2.5 小鼠血清Aβ水平检测

从眼眶取血分离血清,根据ELISA试剂盒说明书进行试验,在450 nm波长处测定光密度值(OD值),根据标准曲线计算血清Aβ1-42浓度(pg/mL)。

1.2.6 小鼠海马Aβ蛋白表达检测

每组取3只小鼠的海马,常规制片后镜检观察Aβ的蛋白阳性表达强度。阳性细胞呈黄色或棕黄色,主要分布在细胞质及细胞间质。采用BA200Digital数码三目摄像显微摄像仪对切片进行图像采集,通过Motic Images Advanced3.2图像分析软件观察100倍镜下连续3个视野,测定各组小鼠海马中显示Aβ蛋白阳性表达强度的OD值。

1.2.7 小鼠 Aβ、TLR4、Myd88、NF-κBp65 检测

取保存的小鼠右侧海马组织各30μg加 1 mL裂解缓冲液,研磨均匀后于冰上裂解30 min,离心(4℃,11000r/min)10 min,取上清液。按样品与5×蛋白上样缓冲液4：1的比例加入后煮沸10 min使其变性。定量后以30μg蛋白上样行电泳。经SDS-Page电泳分离的蛋白质转移至PVDF膜上,膜经5%脱脂奶粉室温封闭1 h 后,将膜与 Actin(1：2000)、Aβ (1： 1000)、 TLR4(1： 500)、 MyD88(1： 1000)、NF-κBp65(1：1000)一抗孵育(4℃)过夜。 经洗涤后,与HRP标记山羊抗小鼠(1：2000)、HRP标记山羊抗兔(1：1000)二抗振荡孵育(37℃)1 h。将NC膜放入荧光化学发光成像仪(ChemiQ4600)对条带显影并进行灰度测定。

1.2.8 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计及分析,所有数据用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对藏区发酵乳平板菌落的计数

通过平板计数法计算菌落数：10-5及10-6级因数量庞大无法计数,10-7级计数结果为(4.48±0.35)×10-9。

2.2 藏区发酵乳对AD模型小鼠认知功能的影响

MWM结果显示,定位航行实验中,与WT组比较,APP/PS1组小鼠的运动轨迹相对杂乱,潜伏期明显延长(P＜0.05);与APP/PS1组比较,Yogurt组及Lac.组小鼠的运动轨迹相对平缓,潜伏期相对缩短(P＜0.001,P＜0.05)。空间探索实验中,与WT组比较,APP/PS1组小鼠穿越平台象限的次数明显减少(P＜0.001);与APP/PS1组小鼠比较,Yogurt组及Lac.组小鼠穿越平台象限的次数相对增加(P＜0.05);与WT组比较,APP/PS1组小鼠在平台象限停留时间明显缩短(P＜0.05);与APP/PS1组比较,Yogurt组及Lac.组小鼠在平台象限停留时间延长(P＜0.05)。各组游泳速度无明显差异(P＞0.05)。详细数据见表1。

2.3 藏区发酵乳对AD模型小鼠海马Aβ1-42的影响

免疫组化结果显示,Aβ1-42蛋白阳性产物主要分布在细胞质及细胞间质。与WT组比较,APP/PS1组小鼠海马Aβ蛋白阳性细胞数明显增多,染色加重,差异具有统计学意义(P＜0.05)。与APP/PS1组比较,Yogurt组、Lac.组小鼠海马Aβ蛋白阳性细胞数减少,差异有统计学意义(P＜0.05),详细情形及数据分别见图1、表2。ELISA法检测小鼠血清Aβ1-42含量结果显示,与APP/PS1组小鼠相比,Yogurt组小鼠血清Aβ1-42表达减少,有统计学意义(P＜0.05),详细数据见表3。免疫组化结果和ELISA结果一致,提示藏区发酵乳可降低AD小鼠脑内Aβ水平。

表1 各组小鼠MWM结果的比较Table 1 Comparison of MWM.Results in each group of m ice

图1 各组小鼠海马Aβ免疫组化图Figure 1 Immunohistochem ical.Results of Aβin hippocam pus ofm ice in each group

表2 各组小鼠海马Aβ免疫组化统计结果Table 2 Immunohistochem ical statistics of Aβin hippocampus ofm ice in each group

表3 APP/PS1、Yogurt组小鼠血清Aβ变化情况Table 3 Changes of serum Aβin APP/PS1 and Yogurt group in m ice

2.4 藏区发酵乳对AD模型小鼠脑内Aβ、TLR4、Myd88、NF-κBp65 蛋白含量的影响

Western

Blot结果显示,与WT组比较,APP/PS1

组小鼠脑内 Aβ、TLR4、MyD88、NF-κBp65 等蛋白的表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与APP/PS1组比较,Yogurt组、Lac.组小鼠脑内 Aβ、TLR4、MyD88、NF-κBp65等蛋白的表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05),详细情形及数据分别见图2、表4。

图 2 各组小鼠海马内 Aβ、M yD88、TLR4、NF-κBp65 蛋白表达图Figure 2 Protein expression of Aβ,M yD88,TLR4,NF-κBp65 in murine hippocampus

表4 各组小鼠海马内Aβ、M yD88、TLR4、NF-κBp65蛋白表达值Table 4 Protein expression of Aβ,M yD88,TLR4,NF-κBp65 in murine hippocampus

3 讨论

AD的发生发展是一个缓慢、复杂的病理过程,由于病因不明,因此目前没有有效治疗药物及措施。研究显示,牛奶和奶制品摄入量的增加可降低AD的患病风险[13];高奶制品的摄入量与提高认知功能有关[14];食用发酵乳制品,可能有助于预防AD[5]。近年来,益生菌作为营养补充品在加工食品中的应用越来越广泛[15],发酵乳是最受欢迎的益生菌产品之一[16]。根据国际发酵乳法典(2008年修订)标准[17]的定义,发酵乳是指以鲜牛奶为原料,经巴氏杀菌后接种乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)发酵制成的乳制品。发酵乳是一种很好的蛋白质来源,具有独特的特性,可以维持肠道微生物生态平衡,提高机体的抵抗力、抑制有害菌对肠道的侵袭[18,19]。益生菌发酵乳对人体健康的益处包括调节免疫、调节肠道菌群、降低血清胆固醇和降低肿瘤风险等[20]。

AD的主要表现为认知功能障碍。为了研究藏区发酵乳长期干预对APP/PS1小鼠的保护作用,我们选择两月龄小鼠进行为期20 w的灌胃干预。我们的研究结果显示,藏区发酵乳组可以减轻APP/PS1小鼠的认知障碍,表现在水迷宫实验中目标象限停留的时间延长。这与之前报道的研究结果一致[21,22]。本结果显示藏区发酵乳可减轻APP/PS1模型小鼠Aβ沉积并且改善认知功能障碍。免疫组化结果和ELISA结果显示,7月龄AD小鼠脑内Aβ表达增加,藏区发酵乳干预后可降低脑内Aβ水平。目前虽然对AD发病机制的理解仍无完整明确的阐述,但Aβ含量增加和神经炎症反应被认为是影响AD发生、发展的一个关键因素[23]。研究表明,TLR4与炎症反应关系密切[24],TLR4通过 Myd88激活NF-κB,形成 TLR4/Myd88/NF-κB信号转导通路,释放炎性细胞因子[25],导致神经元炎症损伤引起Aβ异常聚集;Aβ含量增加,进一步引起神经炎性反应,形成恶性循环。本研究发现,APP/PS1组小鼠脑内TLR4、NF-κBp65的表达水平明显升高,其下游的MyD88的表达水平也明显高于WT组;Yogurt组的NF-κBp65及MyD88水平均降低,说明乳酸菌干预可以抑制NF-κB活性,抑制炎症反应,改善AD病程。

目前有研究发现,肠道微生物群的变化和AD的发生有关[26,27],脑-肠轴的紊乱可能在AD的发病机制中起重要作用[28],肠道微生物群通过代谢、神经内分泌和免疫途径在中枢神经系统的功能发挥中起作用[29]。因此,脑-肠轴在维持大脑健康方面起着至关重要的作用,而肠道菌群是这一轴的主要调节器。益生菌利用脑-肠轴来增加神经单胺类物质〔如多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)和脑源性神经营养因子(BNDF)〕的水平,这些物质对神经元的可塑性和存活至关重要[11]。本实验结果显示,藏区发酵乳能提高AD小鼠空间学习记忆能力,推测它可能通过调控脑-肠轴,及降低以NF-κBp65为核心的神经细胞炎症损伤发挥神经保护作用。

综上所述,我们的数据显示,长期摄入藏区发酵乳制品可有效改善AD模型小鼠的学习记忆能力,这可能与影响Aβ沉积,改善Aβ聚集引起的神经炎症有关。