急性缺血性卒中后基质金属蛋白酶-9活性的MRI/NIRF双功能显像

唐啸，罗莹，徐晓艳

1.武汉科技大学附属天佑医院影像科，湖北武汉 430064；2.武汉科技大学医院内科，湖北武汉 430071；*通讯作者 徐晓艳 xuxiaoy35@163.com

随着人们生活水平的提高和老年人口的增加，急性期缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）已成为威胁人类生命健康的主要疾病。AIS的具体发病机制尚未明确，病因包括血管损伤、抗凝蛋白含量与活性改变、纤维蛋白溶解系统活性减低、凝血因子升高、血液成分改变、血小板活化等，并以血管内皮细胞损伤为主[1-3]。基质金属蛋白酶（matrixmetalloprotease，MMP）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可导致血管内皮细胞的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解与破坏，致使血管损伤[4-5]。MMP-9是MMP家族的成员，与缺血性脑损伤关系密切。粥样硬化斑块中MMPs表达增多，纤维成分大量降解，易诱发AIS的发生[6-7]。特别对于脑卒中患者，MMP-9表达高于其他MMPs类型。目前临床多采用颈部血管B超、多层螺旋CT对AIS患者进行分型，但均存在一定的缺陷[8-9]。MRI和近红外荧光成像（near-infrared fluorescence imaging，NIRF）利用分子影像探针，可在活体无创地评价缺血性卒中的动脉粥样硬化斑块特征[10]；特别是NIRF使非侵入性观察活体内基因蛋白表达和各种细胞活动成为可能，检测灵敏性高；且NIRF采用的探针均针对具体分子靶设计，具有较强的特异性[11-12]。目前MRI/NIRF双功能显像广泛应用于体外细胞研究和动物实验研究阶段[13]；但对于AIS的应用鲜有报道。本研究通过动物模型研究 AIS后MMP-9活性的MRI/NIRF双功能显像特征及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 DAPI为上海碧云天生物技术有限公司提供；非特异性IgG抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothioeyanate，FITC）标记抗MMP-9抗体、兔抗小鼠MMP-9多克隆抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供；NIR 797异硫氰酸酯、大鼠抗小鼠β-actin 单抗（1∶2000）均为美国Sigma公司产品。所有小鼠均喂养于温度、湿度、光照控制的SPF级动物中心。ApoE 基因敲除小鼠（ApoE-/-小鼠）购于医科院基础所动物中心，雄性，14周龄。本实验得到实验伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 AIS 动物模型的建立与分组 15只ApoE-/-小鼠按高脂饮食（0.5%胆酸钠、10%脂肪、2%胆固醇）喂养20周，建立缺血性卒中动物模型。随机选取5只ApoE-/-小鼠按体重经尾静脉注入抗MMP-9抗体NIR 797 1 mg/kg（实验组）；随机选取5只ApoE-/-小鼠注射非特异性IgG-NIR 797 1 mg/kg（对照组）；5只ApoE-/-小鼠注射磷酸盐缓冲液1 mg/kg（空白组）。所有注射剂量均同实验组。24 h后对所有实验小鼠行MRI/NIRF双功能显像。

1.2.2 MRI/NIRF双功能显像 采用Siemens 1.5T 12通道MR 仪，水平扫描架内径16 cm，使用38 mm 小鼠头线圈。①抗MMP-9抗体NIR 797合成。取1 mg NIR 797溶于200 μl DMSO；取2 μl抗-oxLDL抗体溶于0.8 ml 磷酸盐缓冲液，缓慢加入NIR 797-DMSO溶液，混匀后避光保存。②MRI扫描：使用异氟烷-空气混合气体麻醉小鼠并维持，MRI扫描采用轴位快速自旋回波T2WI。扫描参数：TR 4000 ms，TE 34/13 ms，层厚0.5 mm，层间距0，层数35，视野2.8cm×2.8 cm，矩阵256×256，扫描时间约45 min。③NIRF 显像。小鼠注入荧光探针24 h后，使用异氟烷-空气混合气体麻醉并维持，NIRF 扫描激发波长790 nm，曝光时间为500～5000 ins。④图像处理：颈动脉斑块NIRF SI斑块由成像系统自带的Maestro 3.0软件测量，取平均值，根据公式（1）计算信噪比（SNR）。采用MRI后处理工作站的Paravision 5.0软件勾画出匹配MRI图像的感兴趣区（ROI），测量注入荧光探针前后相同层面血管斑块信号强度（SI）改变区的SI（SI斑块），并与相邻肌肉SI（SI肌肉）比较，计算相对信号强度（rSI）。

1.3 病理检查 MRI/NIRF双功能显像完毕后处死小鼠，暴露颈动脉，纵向切开后将颈动脉以最佳切片温度包埋剂包埋，冰冻切片机横断面连续切片，厚度约2 μm，行常规普鲁士蓝与HE染色。测定并记录颈动脉NIRF的阳性面积与颈动脉总面积。同时用FITC标记的抗MMP-9抗体检测斑块内MMP-9分布，染色步骤按试剂说明书进行，细胞核采用DAPI 染色，使用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.4 MMP-9活性检测 取处死小鼠的脑组织，加入500 μl裂解液，充分匀浆。以12 000×g离心15 min，离心温度4℃。收集上清液，采用Bradford 法定量蛋白后，使用Western blot 检测MMP-9与GAPDH的表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件，正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD 法。颈动脉NIRF 阳性面积与脂肪阳性面积的相关性采用Pearson 相关分析，P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-9活性 所有小鼠在AIS模型建立2 h时即可检测到MMP-9表达；模型建立24 h时表达达到高峰（图1）。

图1 缺血性脑卒中不同时间点MMP-9活性

2.2 NIRF显像特征 所有小鼠注入荧光探针后均存活良好。其中实验组与对照组注射24 h后颅脑见强荧光信号，而腹部未见明显荧光信号；空白组颅脑与腹部均未见明显荧光信号；实验组颈动脉NIRF 示强荧光信号主要聚集于斑块好发部位。实验组、对照组与空白组SNR分别为456.39±24.19、19.48±2.19和4.19±0.89，差异有统计学意义（F=144.013，P<0.05）。

2.3 病理染色与免疫荧光状况 实验组小鼠颈动脉NIRF的阳性面积占颈动脉总面积的（39.23±4.22）%，脂肪阳性面积占（41.43±5.43）%，两者呈线性相关（r=0.738，P<0.05）。颈动脉切片免疫荧光染色显示斑块内MMP-9的表达与巨噬细胞的分布一致，荧光信号主要聚集于斑块纤维帽（图2A）。HE染色证实颈动脉粥样斑块形成（图2B）。对照组与空白组NIRF均未见明显荧光信号，但存在典型的动脉粥样斑块病变（图2C）。

图3 缺血性脑卒中病理染色与免疫荧光状况。颈动脉切片免疫荧光染色显示斑块内MMP-9的表达与巨噬细胞的分布一致，荧光信号主要聚集于斑块纤维帽（A）；HE染色证实颈动脉粥样斑块形成（B）；未见明显荧光信号，但存在典型的动脉粥样斑块病变（C）

3 讨论

AIS主要由颈动脉粥样硬化不稳定斑块引起，血管内超声成像、血管造影、CT 等对缺血性脑卒中均具有一定的诊断价值，可显示血管壁厚度、血管腔内狭窄程度及斑块性质，但无法有效反映斑块的生物学特征及其稳定性，导致临床应用受到一定的限制[14-15]。

MMPs是一类对细胞外基质具有降解活性的蛋白酶超家族，可降解斑块的细胞外基质成分而削弱斑块的强度[16]。MMP-9 属于Zn2+依赖性内源性蛋白水解酶，其作用底物包括纤黏蛋白、层黏蛋白、Ⅳ型明胶。在脑卒中发病过程中，缺血-再灌注和氧化应激可使MMP-9表达及活性增加，基底膜降解，从而影响预后[17-18]。血浆MMP-9水平与脑卒中患者病情呈正相关，故可以作为动脉粥样硬化及脑卒中病情活跃的标志物[19]；特别是MMP-9水平增高，可导致斑块不稳定，易脱落形成栓子，是脑卒中发生及再发的危险因素[20]。本研究显示，所有小鼠在缺血性脑卒中模型建立2 h时即可检测到MMP-9的表达，模型建立24 h时达到高峰。动物实验结果也显示，MMP-9表达增加与慢性血-脑屏障损伤关系最为密切，血浆MMP-9水平升高与脑微出血密切相关，可导致小血管结构重构，血管内皮细胞损伤，血-脑屏障受损[21-22]。

随着新技术的不断发展和新设备的不断涌现，影像学技术的创新范围不断扩大，也为缺血性脑卒中的诊断和治疗提供了条件。MRI 具有良好的空间分辨率与重复性，且无创、无辐射，可对动脉粥样病变的发生及发展过程进行监测和示踪[19]。在活体内，血红蛋白、脂质、水对光谱范围为650～900 nm的NIRF 吸收系数最低，可穿透更深层的组织。Alsaid 等[23]研究显示，近红外荧光最大可穿透6 cm的肌肉组织、5 cm的成人脑组织、12 cm的乳腺或肺组织。NIRF的基本原理是以特定波谱范围的激发光源照射荧光分子。此时荧光分子被激发出不同光谱特性的光子信号。此信号通过滤光片后进行采集，并通过数据处理光子信号转换为图像。NIRF 具有灵敏度高、实时成像、操作简便、非侵入性、非电离辐射等优点，其光子量探测阈值低，故检测灵敏度高；与生物发光成像相比，可不必转基因，故操作相对简便[24]。特别是其与各种特异靶向探针的合成可应用于不同疾病的实验性研究，从分子水平为疾病的发生及发展提供诊治信息[25-27]。MRI和NIRF 利用分子影像探针可在活体无创地评价脑卒中颈动脉斑块特征。MMP-9 在斑块的发生、进展和易损斑块的不稳定性等方面发挥重要作用[28-30]。本研究结果显示，在注入探针24 h后，NIRF 显示强荧光信号聚集于实验组小鼠颈动脉粥样硬化病变内，MMP-9的表达与NIRF SNR 呈线性相关，免疫荧光染色证实斑块内MMP-9的表达与巨噬细胞共区域；且抗MMP-9抗体NIR 797 可在颈动脉粥样硬化斑块部位特异性聚集，表明该探针可作为小鼠颈动脉粥样硬化斑块MRI/NIRF 显像的有效工具。

总之，AIS后MMP-9活性的MRI/NIRF双功能显像可作为新的颈动脉斑块诊断方法，对评估AIS 病情具有重要价值。本研究的动物模型数目较少，且模型比较单一，一定程度上可能影响结论的可靠性。本研究未进一步动态观察MRI/NIRF 显像，这将是下一步深入分析的方向。