G蛋白偶联雌激素受体可通过抑制氧化应激反应减轻肾缺血再灌注损伤

章林明许珍珍常越辰司军强马克涛李 丽王勤章李应龙

(1.石河子大学医学院,新疆石河子 832000;2.石河子大学医学院第一附属医院,新疆石河子 832000;3.成都市第五人民医院,成都 610000)

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雌性Sprague Dawley(SD)大鼠40只,8～12周龄,体重220～280 g,来源于新疆医科大学实验动物中心[SCXK(新)2018-0001],动物房内温度为20℃～25℃,湿度为50%～55%,给予标准饲料,自由进食水,周围环境安静。动物手术在屏障动物实验设施内进行[SCXK(新)2018-0003]。动物实验方案经石河子大学医学院动物管理与使用委员会(IACUC)批准(A2046-047-02)。所有大鼠进行去势术后(正常雌性大鼠体内的内源性雌激素也可也以激活GPER,故将所有雌性大鼠去卵巢14 d后进行实验,以排除内源性雌激素对实验的干扰),按照随机数字表法分为去卵巢组(OVX组)、缺血再灌注损伤组(OVX+I/R组)、E2干预组(OVX+I/R+E2组)、GPER特异性激动剂G1干预组(OVX+I/R+G1组)、雌激素+GPER特异性阻断剂 G15干预组(OVX+I/R+G15+E2组),每组8只。

1.2 主要试剂与仪器

17β-雌二醇(Sigma,美国);GPER受体特异性激动剂G1、GPER受体特异性阻断剂G15(ApexBio,美国);鼠抗p-Akt抗体、兔抗Akt抗体(Proteintech,中国);兔抗 p-PI3K抗体、鼠抗 PI3K抗体(Cell Signaling Technology,美国);鼠抗 β-actin抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);大鼠雌激素ELISA试剂盒(上海语纯生物科技有限公司);SOD检测试剂盒、MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);蛋白电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 OVX模型及肾缺血再灌注模型的建立

大鼠给予戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,沿大鼠两侧肋中线备皮,在备皮区域的双侧背部取切口,切口位于肋骨下方约一横指处,切开皮肤后,钝性分离皮下筋膜,并延肌肉边缘分离开肌肉,进入腹腔后,寻找脂肪组织并将其取出,其中粉红色多囊泡组织即为大鼠卵巢。将卵巢切除,消毒之后对大鼠筋膜、肌肉以及切口进行缝合。将大鼠置于37.5℃的恒温手术台上,待大鼠麻醉复苏后,将其放回已预先消毒完毕的鼠笼中进行饲养。两周后所有大鼠术前12 h禁食,自由饮水,用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉成功后,切除右肾,用无创动脉夹夹闭左肾肾蒂造成缺血,持续45 min后,松开动脉夹再灌注24 h。E2干预组于术前1 h皮下注射E2(100μg/kg),G1干预组于术前1 h腹腔注射GPER受体激动剂G1(100μg/kg),G15+E2干预组于术前1.5 h腹腔注射G15(300μg/kg),30 min后皮下注射E2(100μg/kg)[17-18]。

1.3.2 血清雌激素水平检测

将大鼠全血置于室温下静置30 min后,离心：3000 r/min,时间10 min,取上清液,使用ELISA试剂盒按说明书检测各组大鼠E2水平。

1.3.3 肾功能损伤指标检测

大鼠再灌注24 h后,戊巴比妥钠腹腔麻醉,行腹主动脉采血,4000 r/min离心10 min,采用美国Roche Cobas Integra 800全自动血生化分析仪检测血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平。

目前，我们在学校教育方面，也存在许多不完善的地方。一些学校为追求升学率，忽视了对青少年的青春期教育。一些学校对成绩好的同学呵护有加，而对成绩差的学生则放任自流。有的学校甚至对差生采取“停课”或“开除”等措施。不少学生流入社会后，成了“问题少年”。

1.3.4 肾组织病理检查

大鼠再灌注24 h后,戊巴比妥钠腹腔麻醉,左侧肾行原位灌流去除血细胞,切取左肾一半置于-80℃保存备用,另一半置于10%中性福尔马林液中固定,常规石蜡切片和HE染色,×400光镜下观察各组大鼠肾组织病理形态的改变,并进行Paller评分[20]。评分标准如下：肾小管明显扩张计1分;肾小管上皮细胞扁平或肿胀计1分;刷状缘损伤计1分;刷状缘脱落计2分;管型计2分;肾小管管腔内有脱落、坏死(未形成管型或细胞碎屑)计1分;肾小管正常计0分。每个视野下随机选取10个肾小管进行评分,并根据评分结果,评价肾小管损伤程度。

1.3.5 肾组织氧化应激指标检测

从-80℃冰箱中取出预存的肾组织,制成10%组织匀浆,离心：4℃ 3000 r/min,10 min,采用 BCA法测蛋白浓度后,严格遵循SOD试剂盒及MDA试剂盒的说明书进行肾组织SOD活性及MDA含量的检测。

1.3.6 Western blot法检测 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达

取冻存的肾组织,加入适量预冷的蛋白裂解液制成组织匀浆,离心后取上清,用BCA试剂盒检测蛋白浓度,配平蛋白浓度,煮沸10 min使蛋白变性,各组取样50μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。转膜、封闭后,加入一抗4℃过夜;TBST中洗3次,每次5 min;加入二抗室温孵育2 h。暗室曝光。用Image J分析软件检测条带灰度值。以βactin为内参照。

1.4 统计学方法

运用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析,计量资料以平均数±标准差(±s)表示,两组间均数比较采用t检验,组间两两比较采用LSD法,若方差齐性则组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清雌激素水平检测结果

如表1和图1所示,正常SD大鼠OVX术后2周,采用 ELISA法测定雌激素水平。结果表明,OVX组大鼠雌激素水平明显低于正常大鼠。

2.2 肾功能损伤指标检测结果

如表2和图2所示,与OVX组相比,OVX+I/R组大鼠BUN和Cr水平明显升高,提示OVX+I/R组大鼠肾功能受损,模型制备成功。与OVX+I/R组相比,E2干预组与G1干预组Cr和BUN水平明显下降;与E2干预组相比,G15+E2干预组Cr和BUN水平明显升高。

2.3 肾组织病理学改变

如图3所示,HE染色后光镜下肾组织病理学改变：OVX组肾小球、肾小管结构正常,间质无充血水肿,无炎性细胞浸润(图3A);OVX+I/R组肾小管则明显扩张,细胞有不同程度的肿胀甚至坏死以及脱落,肾间质水肿,炎性细胞浸润明显(图3B);E2组和G1组大鼠肾小管轻度扩张,上皮细胞肿胀较轻微,坏死较少,炎性细胞浸润程度明显减轻(图3C、3D);E2+G15组肾小管结构不清,部分上皮细胞出现坏死以及脱落(图3E)。Paller评分结果示表3和图4所示。

2.4 肾组织氧化应激指标检测结果

如表4和图5所示,与对照组相比,IR组大鼠肾组织SOD活性显著降低(P＜0.01),MDA含量明显升高(P＜0.01);与IR组相比,E2和G1干预组大鼠肾组织SOD活性显著升高(P＜0.01),MDA含量明显下降(P＜0.01);而G15+E2组肾组织SOD活性较E2组降低(P＜0.05),MDA含量较E2组明显上升(P＜0.01)。

表1 正常大鼠与OVX术后2周大鼠血清雌激素水平(n=8)Table 1 Serum estrogen levels in normal rats and 2 weeks after OVX rats

图1 正常大鼠与OVX术后2周大鼠血清雌激素水平Note.Compared with Normal group,**P＜0.01.Figure 1 Serum estrogen levels in normal rats and 2 weeks after OVX rats

表2 各组大鼠BUN和Cr的水平(n=8)Table 2 The levels of BUN and Cr in rats from each group

图2 各组大鼠BUN(A)和Cr(B)的水平Note.A,OVX group.B,OVX+I/R group.C,OVX+I/R+E2 group.D,OVX+I/R+G1 group.E,OVX+I/R+G15+E2 group.Compared with OVX group,**P＜0.01.Compared with OVX+I/R group,##P＜0.01,#P＜0.05.Compared with OVX+I/R+E2 group,&&P＜0.01,&P＜0.05.The same as below.Figure 2 The levels of BUN(A)and Cr(B)in rats from each group

图3 各组大鼠肾组织病理学改变(HE染色)Note.A,OVX group.B,OVX+I/R group.C,OVX+I/R+E2 group.D,OVX+I/R+G1 group.E,OVX+I/R+G15+E2 group.Figure 3 Histopathological examination of the renal tissue in rats from each group(HE staining)

表3 各组大鼠肾组织Paller评分(n=8)Table 3 Paller score of the renal tissue in rats from each group

图4 各组大鼠肾组织Paller评分Figure 4 Paller score of the renal tissue in rats from each group

表4 各组大鼠肾组织SOD活性及MDA含量(n=8)Table 4 SOD activity and MDA content of the renal tissue in rats from each group

图5 各组大鼠肾组织SOD活性及MDA含量Figure 5 SOD activity and MDA content of the renal tissue in rats from each group

2.5 Western blot法分析PI3K/Akt通路的激活情况

如图6,Western blot结果显示,与OVX组相比,I/R组肾组织中p-PI3K和p-Akt的表达明显降低(P＜0.01);与I/R组相比,E2和G1干预组p-PI3K和p-Akt的表达明显升高(P＜0.01);E2干预组与G1干预组差异无统计学意义;G15+E2干预组与E2干预组相比,p-PI3K和p-Akt表达明显降低(P＜0.05)。

3 讨论

肾缺血再灌注损伤这一病理生理进程在临床中较为常见,由于肾血供丰富,其对缺血再灌注损伤也极为敏感,故I/R损伤可诱发急性肾功能衰竭(AKI)[21]。目前对I/R损伤的防治主要通过缺血缺氧预适应及药物预处理等。国内外研究已证实雌激素对脑、心及肾等脏器缺血再灌注损伤具有一定保护作用,然而在临床上,由于其为性激素,长期用药会导致一系列严重副作用,故其应用受到了极大限制[22]。若肾I/R损伤后激活GPER受体能发挥肾保护作用,则可使用GPER特异性激动剂G1防治肾I/R损伤,从而避免雌激素带来的一系列问题。本研究结果显示,大鼠肾缺血再灌注损伤后,血清肌酐和尿素氮明显升高,E2干预组和G1干预组均有所下降,而E2+G15干预组血肌酐和尿素氮水平较E2干预组升高,表明E2和G1均可减轻肾缺血再灌注损伤,且特异性阻断GPER后,E2的保护作用明显减弱。形态学结果显示,I/R组大鼠肾小管扩张明显,刷状缘脱落严重,肾小管上皮细胞有不同程度的肿胀、坏死和脱落,肾间质水肿,E2干预组和G1干预组肾小管上皮细胞肿胀和坏死均较少,而E2+G15干预组部分逆转了E2的保护作用,该结果进一步表明E2减轻肾缺血再灌注损伤可能通过GPER介导。

既往研究发现,GPER可以介导17β-雌二醇的抗氧化应激反应,从而改善冠状血管反应性[23]。Wang等人[24]发现雌激素的心脏保护作用是GPER介导的,且敲除小鼠GPER基因后,氧化应激反应加重,导致左心室增大,左心功能下降。氧化应激反应是肾I/R损伤的关键环节,正常生理条件下,细胞可产生少量ROS,但机体的活性酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽GSH等)可以清除ROS,使ROS的产生与清除保持动态平衡,当机体发生缺血再灌注损伤时,产生的ROS明显增多,超出机体清除ROS的能力,机体内SOD及CAT等抗氧化酶活力下降,便发生氧化应激反应,引起组织细胞损伤。由于SOD是体内重要的抗氧化酶和氧自由基清除剂,而丙二醛(MDA)是氧化应激反应的最终产物,SOD活性和MDA含量被作为监测氧化应激反应的两个代表性指标[25]。本研究中,通过检测肾组织SOD活性及MDA含量发现,大鼠肾缺血再灌注损伤后,肾组织SOD活性明显下降,而MDA含量明显升高,提示I/R后肾组织氧化应激反应加重,机体自身的氧自由基清除机制不能完全清除过氧化反应的产物。E2干预组和G1干预组明显逆转了肾组织SOD活性及MDA含量,提示E2和G1可以通过加强机体氧自由基清除作用,减轻氧化应激反应。而E2+G15干预组较E2干预组SOD活性和MDA含量有所下降,表明雌激素减轻氧化应激反应可能主要通过激活GPER来实现。

图6 各组大鼠肾组织p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值的比较Figure 6 The p-PI3K/PI3K ratio and p-Akt/Akt ratio of the renal tissue in rats from each group

有研究表明,PI3K/Akt信号通路激活可以调节机体氧化应激反应,Zhu等人[26]研究发现,CTS通过激活PI3K/Akt信号通路,减轻氧化应激反应和细胞凋亡,保护肾缺血再灌注损伤。此外,G1与GPER结合后也可激活 PI3K/Akt信号通路[18]。GPER激活PI3K后,在细胞膜上生成PIP3,PIP3与细胞内信号蛋白Akt结合,使Akt转位至细胞膜并活化,活化的Akt通过磷酸化参与下游细胞信号转导[14-27]。本研究Western blot结果显示,与对照组相比,缺血再灌注组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值明显下降,且E2和G1干预明显能够上调由I/R引起的p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt下降,而G15干预后,E2上调作用明显减弱,表明E2和G1可能通过PI3K/Akt信号通路发挥保护肾缺血再灌注作用,且E2保护作用可能主要通过激活GPER来实现。

综上所述,E2和G1对肾缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能是通过激活GPER减轻氧化应激反应而实现,且E2和G1可以上调p-PI3K和p-Akt水平,由此我们推测G1与GPER结合后,可能通过激活PI3K/Akt信号通路介导氧化应激反应,减轻肾缺血再灌注损伤,但其具体保护机制还需课题组进一步深入研究。本研究初步验证了G1对肾缺血再灌注损伤的保护作用,为临床上G1防治肾缺血再灌注损伤提供新的药物作用靶点。