贞芪扶正颗粒通过miR-200c/ZEB通路抑制肝癌模型大鼠血管形成

贾 鹂杨志宏马俊利

(唐山职业技术学院基础医学部,唐山 063300)

原发性肝癌为常见恶性肿瘤,具有起病隐匿、发展迅速、侵袭能力强等特征,患者一般预后较差,致死率极高,近年来发病率有升高趋势,在肿瘤致死原因中占第2位[1]。手术切除是治疗肝癌的首要方法,但切除率并不高,影响长期疗效,因此有必要进行深入研究肝癌分子发生机制,对于肝癌的预防、治疗具有十分重要的临床意义。肿瘤血管新生及代谢增强,可进一步促进肿瘤的细胞增殖、侵袭、迁移,是造成肿瘤恶化的重要原因[2]。研究发现miR-200c在肝癌中呈低表达,发挥抑癌基因的作用[3]。体外研究发现miR-200c可通过负调控锌指蛋白(inc finger E-boxbinding protein,ZEB)参与肿瘤EMT过程,然而miR-200c/ZEB与肝癌血管形成的关系,目前尚不清楚[4]。贞芪扶正颗粒主要由女贞子、黄芪组成,具有提高免疫能力,及对骨髓、肝的保护作用,在肿瘤辅助治疗中发挥重要作用,然而对肝癌血管形成的作用,目前尚不清楚,本研究制备肝癌模型大鼠,并给予贞芪扶正颗粒干预,旨在探究其对肝癌大鼠血管形成的作用及可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

76只3月龄雄性Wistar大鼠,体重(200±10)g,SPF级,购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011],饲养于华北理工大学动物房[SYXK(京)2017-0022];饲养室温为 23℃ ～25℃,空气相对湿度为50%～70%,饲养1周后用于模型制备。本研究获得华北理工大学实验动物福利与伦理委员会批准同意(IACUC20180419),并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

贞芪扶正颗粒购于甘肃扶正药业科技股份有限公司,批号：20171214,规格：每袋15 g;二乙基亚硝铵(Diethyl ammonium nitrite,DEN)(N0258)购于美国Sigma公司;RIPA裂解液(P0013D)、HE染色试剂盒(C0105)购于碧云天生物技术研究所;免疫组化检测试剂盒(I001-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(H044)、谷丙转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,ALT)(C009-2-1)、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,AST)(C010-2-1)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所;RNA提取试剂盒(R1200)购自北京索莱宝公司;实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测试剂盒(KK4652)购于Sigma-Aldrich公司;兔抗鼠ZEb-2(ab138222)、VEGF抗体(ab53465)、山羊抗兔HRP标记二抗(ab205719)购于英国Abcam公司;兔抗鼠CD34(3569)、β-actin抗体(3700)购自美国CST公司;ELX800自动酶标仪购于美国BioTECK公司;IPSE55I光学显微镜购于日本尼康公司;Sysmex CHEMIX800型全自动生化分析仪购自日本希森美康公司;ChemiDoc XRS凝胶成像仪购于美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备

随机挑选64只大鼠进行肝癌模型复制,参照间断小剂量DEN诱导肝癌大鼠法造模[5],腹腔注射0.2%DEN大鼠(20 mg/kg),每周给药3次,持续4周,随后停药2周,第7周开始灌胃大鼠0.01%DEN,持续4周,第11周灌胃0.02%DEN,14周结束喂养。随机选取2只大鼠处死后,切除瘤组织进行病理组织学检测造模是否成功。排除死亡大鼠,共48只大鼠造模成功,造模成功率为75.00%。另设12只大鼠作为对照组(Control),不进行任何处理。

1.3.2 动物分组与给药

造模后将大鼠分为Model组、贞芪扶正颗粒组、si-miR-200c组、贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组,每组12只大鼠。贞芪扶正颗粒组：造模结束后给药贞芪扶正颗粒,参考文献[6],剂量为2.62 g/kg。si-miR-200c组：造模结束后注射20 pm si-miR-200c,参考文献[7],剂量为20 pm。贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组：造模结束后用1 mL无菌注射器尾静脉注射20 pm si-miR-200c,随后给药贞芪扶正颗粒,剂量为2.62 g/kg。 Control、Model组灌胃等量生理盐水,各组均连续处理8周。

1.3.3 观察指标与检测方法

(1)样本收集

末次处理后将大鼠麻醉后处理,沿腹中将腹腔剪开,游离肠系膜和肠管,暴露主动脉后抽取2 mL腹主动脉血,5000 r/min离心15 min,置于-20℃保存。血液采集后,迅速获取肝组织,切除部分肝组织放置在4%多聚甲醛溶液中固定,另外一部分肝组织置于-80℃保存。

(2)血清 VEGF、ALT、AST 水平检测

采用酶联免疫吸附法检测血清中VEGF水平,具体参考试剂盒说明书进行操作。ALT、AST水平用全自动生化仪测定。

(3)HE染色观察大鼠肝组织病理形态学变化情况

取出固定肝组织,冲洗后在分级乙醇溶液中脱水后,置于二甲苯中透明处理,石蜡包埋后,制备6μm厚度组织切片,60℃烘烤后经二甲苯脱蜡、分级乙醇脱水后采用苏木素染液对切片染色5 min,清水冲洗后置于1%盐酸乙醇中30 s,冲洗后采用伊红染液复染2 min,经脱水、透明、封片后置于光镜下观察肝组织病理学变化情况。

(4)qRT-PCR法检测肝组织中miR-200c表达

采取RNA提取试剂盒提取肝组织中总RNA,参考反转录试剂盒反转录后为cDNA,配制25μL扩增体系：上下游引物分别为1.25μL,cDNA 2μL,2×SYBR Green反应液 12.5μL,无 RNA酶水 5.5 μL。反应程序参数：95℃预变性15 min,94℃ 15 s,55℃ 30 s,40个循环,每个样本设定三个重复孔,采用2-ΔΔCt法计算肝组织中 miR-200c表达量。miR-200c上游引物序列：5’-GCCCGCTAATACTGCCG GGTA-3’;下游引物序列：5’-CAGTGCTGGGTCC GAGT-3’。 内参 U6 上游引物序列：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’;下游引物序列：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

(5)免疫印迹法检测肝组织中ZEb-2、VEGF蛋白表达

取出保存肝组织,剪碎后添加RIPA裂解液裂解组织,5000 r/min离心20 min后,利用BCA试剂盒检测组织蛋白总浓度,经SDS-PAGE电泳后分离目的蛋白,湿转法转移蛋白至PVDF膜上,添加封闭液封闭后,将膜与兔抗鼠ZEb-2、VEGF、β-actin一抗抗体(1∶300)在4℃环境中过夜,次日室温下添加二抗(1∶5000)孵育1 h,清洗后避光显影,在凝胶成像仪内观察蛋白条带,并采用Image-J软件定量分析各个蛋白相对表达量。

(6)免疫组化检测检测肝组织中ZEb-2、VEGF、MVD阳性表达率

肝组织石蜡切片经脱蜡、水化后,加入 3%H2O2灭活过氧化物酶活,热抗原修复后,用10%山羊血清封闭抗原,添加ZEb-2、VEGF、CD34一抗(1∶500),室温下放置2 h后,置于4℃冰箱内孵育过夜,室温下添加二抗孵育1 h,避光下添加DAB显色液显色5 min,置于显微镜下观察蛋白染色情况。ZEb-2阳性：细胞核内出现棕黄色或黄色颗粒为阳性;VEGF、MVD：细胞质内出现棕色颗粒为阳性。利用Image-J软件定量分析阳性表达率,阳性表达率=染色阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.4 统计学方法

本研究数据采用SPSS 22.0软件进行分析。计量资料以平均数±标准差(±s)描述,多组间比较行单因素方差分析,进一步两两对比采用SNK-q检验,当P＜0.05时,则差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况比较

Control组大鼠饮食、精神状态、活动均正常;Model组大鼠进食量减少,精神萎靡,毛发蓬乱。与Model组相比,贞芪扶正颗粒组大鼠状态得到一定的改善,si-miR-200c组大鼠状态更差,贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组变化不显著。末次处理结束后,si-miR-200c组大鼠存活率最低,Control组大鼠生存率为100%,见表1。

表1 各组大鼠生存情况比较Table 1 Comparison of survival status of each group of rats

2.2 各组大鼠血清中VEGF及肝功能指标变化情况

与 Control组相比,Model组 VEGF、ALT、AST 水平升高(P＜0.05)。与Model组相比,贞芪扶正颗粒组 VEGF、ALT、AST 水平降低,si-miR-200c组VEGF、ALT、AST 水平升高(P＜0.05)。 贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组 VEGF、ALT、AST水平低于 simiR-200c组(P＜0.05),见表 2。

2.3 HE染色观察大鼠肝病理形态学变化情况

Control组肝组织细胞核染色清晰,细胞排列整齐;Model组癌细胞出现较明显变形,细胞核变大,核质比例增大,核仁染色不明显,较多细胞核出现分裂,细胞排列弥散不规则,伴有变性、坏死及炎性细胞浸润。贞芪扶正颗粒组肝组织细胞变形程度减轻,伴有少部分坏死细胞,癌细胞分化程度较高,炎性浸润程度降低;而si-miR-200c癌细胞明显增多,细胞变形增加,分化程较低,出现大量坏死、变形、炎性细胞。贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组细胞变形、坏死数量有所减少,但与Model组相比无显著性变化,见图1。

表2 各组大鼠血清VEGF、ALT、AST水平比较(±s)Table 2 Comparison of serum VEGF,ALT,AST levels in each group

表2 各组大鼠血清VEGF、ALT、AST水平比较(±s)Table 2 Comparison of serum VEGF,ALT,AST levels in each group

注：与Control组相比,*P＜0.05;与Model组相比,#P＜0.05;与贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组相比,a P＜0.05。Note.Compared with control group,*P＜0.05.Compared with model group,#P＜0.05.Compared with Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c Group,a P＜0.05.

组别Groups n 血管内皮生长因子(ng/L)VEGF谷丙转氨酶(U/L)ALT谷草转氨酶(U/L)AST Control组Control group 12 18.13±2.44 65.38±7.87 96.13±10.75 Model组Model group 8 283.19±31.36* 251.51±26.16* 285.46±33.23*贞芪扶正颗粒组Zhenqi Fuzheng granules group 10 225.28±33.25*#a 176.14±24.25*#a 161.16±27.36*#a si-miR-200c组si-miR-200c group 6 321.41±35.07*#a 284.86±25.36*#a 322.47±22.94*#a贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group 8 275.32±36.27* 246.08±31.28* 272.97±25.19*

图1 HE染色观察大鼠肝组织病理形态情况Figure 1 Observe the pathological morphology of rat liver tissue by HE staining

2.4 贞芪扶正颗粒对肝组织中ZEB/miR-200c通路与VEGF表达的影响

与Control组相比,Model组 miR-200c表达降低,ZEb-2、VEGF蛋白表达升高(P＜0.05)。与Model组相比,贞芪扶正颗粒组miR-200c表达升高,ZEb-2、VEGF蛋白表达降低,si-miR-200c组miR-200c表达降低,ZEb-2、VEGF蛋白表达升高(P＜0.05)。贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组miR-200c表达高于si-miR-200c组,ZEb-2、VEGF蛋白表达低于 si-miR-200c组(P＜0.05),见图2、表3。

2.5 贞芪扶正颗粒对肝组织中ZEb-2表达的影响

与Control组相比,Model组ZEb-2阳性表达率升高(P＜0.05)。与Model组相比,贞芪扶正颗粒组ZEb-2阳性表达率降低,si-miR-200c组ZEb-2阳性表达率升高(P＜0.05)。贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组ZEb-2阳性表达率低于 si-miR-200c组(P＜0.05),见图 3、表 4。

图2 免疫印迹法检测大鼠肝组织ZEb-2、VEGF蛋白表达情况Note.A,Control group.B,Model group.C,Zhenqi Fuzheng granules group.D,si-miR-200c group.E,Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group.Figure 2 Detection of ZEb-2 and VEGF protein expression in rat liver tissue by Western blot

表3 各组肝组织中miR-200c、ZEb-2、VEGF表达比较(±s)Table 3 Comparison of miR-200c,ZEb-2,and VEGF expression in liver tissue of each group

表3 各组肝组织中miR-200c、ZEb-2、VEGF表达比较(±s)Table 3 Comparison of miR-200c,ZEb-2,and VEGF expression in liver tissue of each group

注：与Control组相比,*P＜0.05;与Model组相比,#P＜0.05;与贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组相比,a P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Compared with Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group,a P＜0.05.

Control组Control group 12 1.05±0.13 0.22±0.04 0.28±0.03 Model组Model group 8 0.42±0.05* 0.72±0.09* 0.66±0.07*贞芪扶正颗粒组Zhenqi Fuzheng granules group 10 0.64±0.09*#a 0.41±0.05*#a 0.39±0.05*#a si-miR-200c组si-miR-200c group 6 0.27±0.05*#a 0.84±0.08*#a 0.79±0.09*#a贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group 8 0.40±0.07* 0.69±0.07* 0.68±0.08*

图3 免疫组化检测肝组织ZEb-2阳性表达Figure 3 ZEb-2 positive expression in liver tissue detected by immunohistochemistry

2.6 贞芪扶正颗粒对肝组织中VEGF、微血管密度(MVD)表达的影响

与Control组相比,Model组VEGF、MVD阳性表达率升高(P＜0.05)。与Model组相比,贞芪扶正颗粒组VEGF、MVD阳性表达率降低,si-miR-200c组VEGF、MVD阳性表达率升高(P＜0.05)。贞芪扶正颗粒+si-miR-200c组VEGF、MVD阳性表达率低于si-miR-200c组(P＜0.05),见图4、表5。

表4 各组肝组织中ZEb-2阳性表达比较Table 4 Comparison of ZEb-2 positive expression in liver tissue of each group

图4 免疫组化检测肝组织VEGF、MVD阳性表达Figure 4 Immunohistochemical detection of positive expression of VEGF and MVD in liver tissue

表5 各组肝组织中VEGF、MVD阳性表达比较Table 5 Comparison of positive expression of VEGF and MVD in liver tissue of each group

3 讨论

DEN为亚硝基化学致毒剂,进而机体后能够使DNA双链编码错误,进而导致肝癌形成[8]。本研究采用改良DEN诱导法,结果发现模型组肝组织多数细胞坏死,伴有炎性细胞浸润,细胞不典型增生,发生水肿、纤维化,排列不规则,呈团状或索状,弥漫性分组在组织中,这与肝癌病理学检测结果相符[9]。血清检测发现模型组肝功能指标ALT、AST水平显著升高,表明模型大鼠肝功能受损,进一步提示肝癌模型大鼠复制成功。

贞芪扶正颗粒主要由黄芪与女贞子两味中药材组成,药理学研究显示其可保护骨髓与肾上腺皮质功能,提高机体免疫力[10]。文献报道显示其中主要药材黄芪能够抑制肝癌细胞的增殖,通过下调MMP-2、bFGF的表达抑制肝癌新生血管的形成[11]。动物研究发现贞芪扶正颗粒可明显降低大鼠炎症反应,缓解肝纤化程度[12]。以上研究均提示贞芪扶正颗粒对肝疾病具有一定的治疗作用。本研究发现与Model组相比,贞芪扶正颗粒组肝组织细胞坏死程度、炎性浸润程度均减轻,肝功能指标ALT、AST水平显著降低,推测贞芪扶正颗粒能够改善肝癌大鼠肝组织损伤及肝功能障碍。

恶性肿瘤的增殖具有显著的血管生成依赖性,新生血管也是肿瘤迅速增殖的形态学基础。VEGF作为血管生成刺激因子可与内皮细胞特定受体结合,进而刺激内皮细胞增殖,诱导肿瘤血管新生。过往研究发现VEGF为强烈的血管发生蛋白,能够制剂刺激、趋化内皮细胞,促进肝癌等其它多种肿瘤血管形成[13]。文献报道MVD为评定肿瘤血管形成的金标准,与肿瘤的浸润及转移有着密切关系,肝癌肿瘤血管生成在肝癌的发展中具有重要作用,通过测定肝癌MVD能够反应肝癌的血管生成状况[14]。本研究发现与Control组相比,Model组肝组织中VEGF蛋白表达显著升高,且VEGF、MVD阳性表达率明显升高,经贞芪扶正颗粒干预后VEGF、MVD阳性表达率显著降低,推测贞芪扶正颗粒对肝癌新生血管具有一定的抑制作用。

miR-200c为miR-200家族成员之一,定位在12号染色体,与肿瘤的发生、发展相关,通过调控靶基因如ZEb-1、ZEb-2等表达进而影响肿瘤细胞侵袭、迁移、上皮间质转化进程[15-16]。既往研究发现miR-200c在多种肿瘤中均下调表达,如miR-200c通过靶向kras抑制乳腺癌的增殖[17]。Zhou等[18]研究发现miR-200c通过靶向ZEb-1抑制非小细胞肺癌、增殖、侵袭、迁移。近期在肝癌患者中研究发现肝癌患者血清中miR-200c表达明显低于正常者,且与患者发生肝转移有关[19]。本研究发现与Control组相比,Model组肝组织中miR-200c表达明显降低,经贞芪扶正颗粒干预后miR-200c表达升高,推测miR-200c在肝癌发正中发挥抑癌作用。司青乐等[20]研究发现肾透明细胞癌中过表达miR-200c,可显著降低ZEb-2表达,推测两者以负调控关系参与肾癌的发生。在胃癌细胞中上调miR-200c可降低ZEb-2表达进而抑制细胞EMT过程[21]。本研究发现与Control组相比,Model组肝组织中ZEb-2表达明显升高,经贞芪扶正颗粒干预后ZEb-2表达降低,结合以上报道推测miR-200c、ZEb-2可能以负调控参与肝癌的发生,为进一步证实肝癌中两者的关系,本研究采用si-miR-200c干预肝癌模型,发现肝癌大鼠肝组织细胞坏死程度、炎性浸润程度增加,癌细胞分化程度降低,而肝组织中VEGF、MVD表达升高,ZEb-2蛋白表达升高,推测miR-200c可能通过负调控ZEb-2促进肝癌新生血管形成,进而加速肝癌细胞恶化。而贞芪扶正颗粒联合si-miR-200c干预后,与si-miR-200c组相比,肝组织细胞损伤程度降低,VEGF、MVD、ZEb-2蛋白表达降低,推测贞芪扶正颗粒可能通过上调miR-200c表达,负调控ZEb-2表达,进而抑制肝癌血管形成及肝癌的进展。

综上所述,贞芪扶正颗粒能够改善肝癌模型大鼠肝组织损伤,保护肝功能、抑制肿瘤血管形成,其可能是通过调控miR-200c/ZEB通路实现的。然而本研究仅从动物模型探究贞芪扶正颗粒对肝癌血管新生的抑制作用,其具体机制尚不明确,还有待采用细胞实验内进一步验证。