利用CRISPR/Cas9技术构建Bpi基因敲除小鼠

张 雨郭中坤付 彬雷 战聂爱蕊庄峰锋王可洲*

(1.济南大学/山东省医学科学院医学与生命科学学院,济南 250200;2.山东省实验动物中心,山东第一医科大学(山东省医学科学院),济南 250002)

杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,Bpi),最早在1978年由英国科学家Weiss等[1]在人中性粒细胞中分离纯化而得到,存在于人、牛、猪等哺乳动物嗜中性粒细胞中。成熟的Bpi是由456个氨基酸残基组成的一种阳离子抗菌蛋白,由氨基端、羧基端和富含脯氨酸的21个氨基酸残基形成的中间连接单位三部分组成,相对分子质量为55×103。其经胰蛋白酶水解,可裂解为30×103的氨基部分和20×103的羧基部分[2]。这两个部分在杀菌过程中所承担的角色也不相同[3]：氨基部分主要起杀菌作用,而羧基部分起调理素的作用,可促使吞噬细胞吞噬入侵的细菌。研究发现,Bpi兼具有广谱杀伤革兰氏阴性菌和中和内毒素的作用[4],其主要生物学功能为协助嗜中性粒细胞抑制细菌生长,发挥抗感染免疫保护作用[5]。

CRISPR/Cas9系统是近年来兴起的一种新型基因编辑技术。它是一种原核生物免疫系统,被用来抵抗噬菌体病毒和外源质粒等外来遗传物质的入侵[6]。它能够识别并切断外源DNA[7],正是由于如此精确的靶向功能,使得外源基因的表达被沉默。CRISPR/Cas9系统在基因编辑过程中主要依赖于sgRNA和靶序列DNA的互补配对[8]。因此,只需要根据目标基因靶点识别的前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)设计一段20～24 bp的引物序列sgRNA,识别并结合到基因序列上,Cas9核酸内切酶就会在靶序列位置切割基因序列,从而会引起自身修复系统对DNA进行修复[9],如同源重组修复机制(homology directed repair,HDR)或非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining,NHRJ),最终使基因组DNA缺失、插入或发生移码突变[10],从而对目的基因进行有效的敲除、敲入或修饰等,完成基因编辑。通过编辑小鼠受精卵细胞的基因[11],并引入代孕母鼠体内,从而实现基因编辑小鼠模型的构建。2013年初,已有实验组[12]将CRISPR/Cas9技术成功地运用在小鼠和人细胞中并实现了精确的基因编码,随之而来的便是CRISPR/Cas9技术的迅速发展,其在基因编辑领域发挥着巨大的发展潜力。

本研究利用CRISPR/Cas9技术剪切 Bpi蛋白的基因编码区,小鼠受精卵细胞通过NHEJ的DNA修复,在蛋白编码区产生片段删除,使得Bpi蛋白失活,从而实现Bpi基因敲除的目的。成功构建的Bpi基因敲除小鼠为后续研究其基因生物学功能及其机制提供了动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6雌鼠30只,体重14～15 g,4周龄;SPF级C57BL/6雄鼠15只,体重20～21 g,8～12周龄;SPF级ICR结扎雄鼠15只,体重26～28 g,8～12周龄;SPF级ICR雌鼠15只,体重30～32 g,8～12周龄,均购自北京唯尚立德生物科技有限公司[SCXK(京)2016-0009]。本研究实验动物先后在北京唯尚立德生物科技有限公司[SYXK(京)2016-0039]和山东省实验动物中心[SYXK(鲁)2019-0007]IVC笼具内饲养。经山东省实验动物中心审批(20181224-01),并严格遵循实验动物使用的3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

金牌mix(green)(北京擎科生物科技有限公司,LOT：TSE101);引物序列合成(上海生工生物工程有股份限公司合成,LOT：240038139);动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(北京君诺德生物技术有限公司,LOT：0180331AX);Cas9 mRNA、Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司,LOT：VK007);注射用人绒毛膜促性腺激素(hCG)(宁波第二激素厂,LOT：181223);注射用血促性素(PMSG)(宁波第二激素厂,LOT：1905152);OTOPO零背景PCR平末端克隆试剂盒(北京华恒健生物科技有限公司,LOT：HHK826);HiScribe T7 ARCA mRNA试剂盒(NEB公司,LOT：E2065S)。

体视显微镜(Nikon SMZ745T,日本);显微注射用显微镜(Nikon ECLIPSE Ts2,日本);拉针仪(NARISHIGE PN-31,日本);PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler 50x,德国);高速冷冻离心机(Eppendorf 5424R,德国);水平电泳仪(北京君意 JY600C,中国);凝胶成像系统(UVP EC3Chemi,美国)等。

1.3 实验方法

1.3.1 根据Bpi序列结构,分析CRISPR/gRNA靶点设计位置

通过NCBI和Ensembl网站查询当前Bpi基因数据(NCBI：Gene ID：329547,Ensembl,Gene：BpiENSMUSG00000052922),对其转录产物及其保守区域进行分析,以设计CRISPR/gRNA靶点设计位置。

1.3.2 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录与靶点活性检测

使用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒将设计的gRNA靶点体外转录成sgRNA并检测转录产物活性,检测原理及具体方法参见唯尚立德VK007试剂盒说明书。同时进行Cas9 mRNA的体外转录用于后续的显微注射,具体方法参见NEB-E2065S试剂盒说明书。

1.3.3 小鼠超数排卵、受精卵注射以及胚胎移植

向预先准备好的4周龄左右的C57BL/6雌鼠腹腔注射血促性素和人绒毛膜促性腺激素,每只注射剂量约为5 U,两次注射间隔48 h。在给药18 h后,将注射激素后的C57BL/6雌鼠以及1只8～12周龄C57BL/6雄鼠处死,分别取出雌鼠的输卵管膨大部以及雄鼠的附睾,在体视显微镜下分别收集卵子和精子。使精子在获能液中获能,取液体边缘的精子滴加到短暂培养的卵细胞中,体外受精3～4 h。将体外转录成功的sgRNA与Cas9 mRNA分别用无RNA酶水稀释到25 ng/μL和50 ng/μL,通过显微注射的方式导入到小鼠受精卵细胞质中,将存活的状态良好的受精卵移植到与结扎雄鼠合笼后见栓的ICR雌鼠输卵管膨大部,缝合,将代孕雌鼠饲养于IVC环境。

1.3.4 F0代小鼠的基因型鉴定和DNA测序

F0代鼠出生后约一周龄剪取小鼠脚趾并编号,使用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取小鼠DNA。根据被敲除的序列位置设计鉴定用PCR扩增引物,基因敲除示意图及引物信息分别如图1、表1所示,PCR扩增体系及反应程序如表2所示。对PCR扩增产物进行T-A克隆(具体方法参见华恒建HHK826试剂盒说明书),并进行DNA测序。

表1 引物名称及其序列Table 1 Primer name and sequence

表2 PCR扩增体系及反应程序Table 2 PCR amplification system and reaction procedure

1.3.5 F0代小鼠的饲养与扩繁

经过对F0代小鼠的基因型鉴定及DNA测序,筛选出成功发生基因突变的阳性首建鼠与C57BL/6野生型小鼠进行交配,待F1代小鼠出生后,再次利用上述鉴定方法对敲除情况进行鉴定,筛选出敲除情况相同且性别不同的F1代小鼠进行近交,F2代小鼠继续进行基因型鉴定,以建立稳定遗传Bpi基因型敲除小鼠品系。

2 结果

2.1 CRISPR/gRNA靶点设计

查询Bpi基因组数据得,该基因存在3个转录产物,且对Bpi基因的蛋白功能保守区域进行分析,如图2、图3所示。根据Bpi基因组结构和蛋白功能保守区,选取Bpi-201进行设计,其中外显子2和外显子3(44～125 aa)为公共外显子,蛋白编码区的碱基数为244 bp是非3的倍数,在保守功能区Bpisuperfamily的N端。在删除外显子2～3后mRNA重新剪拼形成新的mRNA,其编码的蛋白将会发生移码突变,使蛋白失活。因此决定在外显子2和外显子3的两端设计靶点,如图4所示。

根据Bpi基因组结构和蛋白功能保守区,设计了如下gRNA靶点,如表3所示：

图2 Bpi基因的3种转录途径Note.The length of three transcription pathways(Bpi-201,202,203)is 486 aa,483 aa,482 aa,respectively,the difference region is located in exon 9-10(Ensembl,Gene,Bpi ENSMUSG00000052922).Figure 2 Three transcripts of Bpi gene

图3 Bpi基因的保守区域Note： Exon 2～3(130～373 bp)is located in the N-terminal of the conservative BPI superfamily(106～777 bp).Figure 3 Conservative domain of Bpi gene

图4 转录产物Bpi-201的基因组结构Note.The green arrows indicate the cutting positions of gRNA targets.Figure 4 Genome structure of transcription product Bpi-201

2.2 高活性Cas9/gRNA敲除靶点筛选

使用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测以上设计的gRNA靶点活性,Cas9/gRNA体外酶切结果及gRNA靶点活性数据分析如图5所示。靶点活性评价标准详见唯尚立德VK007试剂盒说明书。根据体外酶切结果分析得出：除Bpi-L5、Bpi-R1、Bpi-R2、Bpi-R3外,gRNA靶点的活性均在85%以上。我们选择Bpi-L4、Bpi-R4一对gRNA靶点进行体外转录用于小鼠受精卵的注射。

2.3 F0代小鼠的鉴定及子代繁育

显微注射后,收获了64枚受精卵,将这些卵移植至2只见栓代孕ICR雌鼠的双侧输卵管膨大部。待其生产后,共获得F0代仔鼠22只,对其进行基因型鉴定和DNA测序后,选取一只单链缺失708 bp碱基的阳性首建鼠3号雄鼠,其PCR鉴定结果及TA克隆测序峰图如图6所示。将3号杂合子阳性首建鼠与C57BL/6野生型小鼠进行交配,所得8只F1代仔鼠基因型PCR鉴定结果如图7所示,突变型小鼠电泳结果在550 bp位置出现清晰条带,且测序结果分析得出同样碱基缺失708 bp,证明该缺失可被稳定遗传(在F和R一对引物用于杂合子小鼠的鉴定过程中,由于PCR条件的原因出现1258 bp野生型条带的情况是偶然性的,说明F和R这对引物不适合用于杂合子小鼠的野生型鉴定,故单独设计WT-R用来做野生型鉴定)。F1代杂合子小鼠间进行近交。出生的11只F2代小鼠中,有4只小鼠出现清晰突变型条带,并且未出现野生型条带,且PCR扩增产物测序结果表明同样碱基缺失708 bp,证明成功获得F2代Bpi基因敲除纯合子小鼠,基因型PCR鉴定结果如图8所示,F1代和F2代小鼠基因型总数统计结果如表4所示。

3 讨论

3.1 Bpi基因敲除小鼠遗传稳定品系的建立

本研究利用Cas9技术最终获得22只F0代小鼠。通过基因型鉴定及DNA测序的方式进行筛选,最终获得5只基因片段删除的F0代阳性首建鼠。为了确保产生的基因突变能够稳定遗传,将F0代小鼠与同品系同背景的野生型小鼠进行交配,选择其中稳定产生基因突变的后代进行下一步的繁育。该实验为了获得尽可能多的Bpi基因敲除小鼠用于下一步的实验研究,将性成熟的F1代阳性鼠之间进行近交,获得F2代小鼠,其中包括4只Bpi基因敲除纯合子小鼠。将F2代阳性小鼠之间雄鼠与雌鼠1∶2合笼,经过一段时间的饲养、繁殖与鉴定,目前已获得了一定数量的Bpi基因敲除小鼠。这为深入研究Bpi基因的相关生物学功能及其机制提供了良好的实验模型,对整体实验研究的开展具有重要的意义。

3.2 CRISPR/Cas9技术基因敲除小鼠的脱靶风险

在现代医药生物领域中,借助CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建基因敲除小鼠模型的试验研究有很多,其作为一种新型的基因编辑工具,相较于传统基因编辑技术具有操作便捷、低成本、高效率等优点。然而,此系统存在的潜在脱靶风险仍需要谨慎对待。多项研究认为,sgRNA序列、PAM序列以及Cas9均为引起脱靶效应的可能性因素[13],且有研究发现,通过增强sgRNA的特异性、控制Cas9-sgRNA的用量、优化Cas9核酸酶或选择合适的Cas9递送载体等方法可以不同程度地降低脱靶效应。尽管如此,CRISPR/Cas9技术的脱靶问题仍然不能完全避免。因此,为保证成功构建出Bpi基因敲除小鼠模型,对基因敲除小鼠进行基因型PCR鉴定和DNA测序,这也是必不可少的一步。

表3 gRNA靶点名称及序列Table 3 Name and sequence of gRNA target

图5 Cas9/gRNA靶点活性检测结果Note.A,Results of Cas9/gRNA enzyme digestion in vitro(NC is negative control).B,Analysis of activity data of gRNA target.Figure 5 Detection results of Cas9/gRNA target activity

图6 Bpi敲除小鼠F0代仔鼠1-22号基因型鉴定结果及T-A克隆测序峰图Note.A,Genotyping results showing the mutant strip indicated with red arrows(Primers,F and R,M,DL2000 Marker).B,Sequencing peak map of F0 offspring rat No.3 male(Base deletion,708 bp).Figure 6 Genotyping of 1-22 in F0 offspring of Bpi knockout mice and peak map of T-A cloning and sequencing

图7 Bpi敲除小鼠F1代仔鼠1-8号基因型鉴定结果Note.Knockout identification shown by red arrow-indicated mutant strip(Primers,F and R)and WT identification(Primers,F and WT-R)on the left lanes 1-8 and right lanes 1-8,respectively.M,DL2000 Marker.Figure 7 Genotyping of 1-8 in F1 offspring of Bpi knockout mice

图8 Bpi敲除小鼠F2代仔鼠1-11号基因型鉴定结果Note.Knockout identification shown by red arrow-indicated mutant strip(Primers,F and R)and WT identification(Primers,F and WT-R)on the left lanes 1-11 and right lanes 1-11,respectively.M,DL2000 Marker.Figure 8 Genotyping of 1-11 in F2 offspring of Bpi knockout mice

表4 子代鼠各基因型数量统计Table 4 The number of genotypes in offspring

3.3 Bpi基因敲除小鼠的表型变化

本研究所构建的Bpi基因敲除小鼠,纯合子小鼠与野生型小鼠在毛色、胎仔数量、仔鼠8 W内存活率等表型方面均无明显差异,通过提取Bpi基因敲除小鼠睾丸组织RNA,进行RT-PCR扩增,未见Bpi基因外显子转录水平表达。Bpi基因敲除小鼠在mRNA水平、蛋白质水平表型鉴定及其免疫因子、激素水平方面的变化与数据分析,将在后续研究中进行更加深入的探讨。经编辑后的Bpi基因在F1代基因组中实现稳定的生殖系专递,并在F2代中获得纯合子小鼠。纯合子小鼠在毛色、外形等外观表型上没有明显变化。

3.4 构建Bpi基因敲除小鼠的意义

Bpi作为一类杀菌性蛋白,其对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺痢疾杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌和奈瑟球菌等均有抑制和杀伤作用[14],关于Bpi的作用机制,目前研究解释为带正电荷的阳离子Bpi蛋白与革兰氏阴性菌表面LPS(脂多糖)结合后,LPS在菌细胞膜上的正常排列被破坏,从而导致细胞渗透性显著增强进而引起细菌细胞的裂解[15],使细菌的生长受到抑制甚至最终导致细菌裂解死亡。有研究发现,Bpi不仅承担杀菌作用和中和内毒素的作用,其对于促进伤口愈合也具有积极的作用[16]。另外,在正常情况下,Bpi在小鼠的睾丸和附睾中被检测到高水平表达[17],这也提示了Bpi亦有可能对精子的发生与成熟等生殖功能具有影响作用。Bpi的杀菌机制及其它可能存在的未知生物学功能亟待被探索和发现。目前,在科学领域对Bpi的相关研究较少,本课题构建小鼠Bpi基因敲除小鼠模型,为今后对Bpi功能更为深入的探索和发现奠定了基础。

3.5 Bpi——潜在的新型抗菌药物

抗生素的滥用导致了大量耐药菌株的出现,寻找一类新型的特异性药物来对抗某些耐药菌已成为当务之急。有研究发现,Bpi作为生物机体内一类能够特异性杀伤革兰氏阴性菌的抗菌性蛋白,将其主要发挥抗菌作用和结合内毒素功能的氨基端与其它生物活性因子结合,重组成一种新型的融合蛋白,有助于研制一类新型的抗菌多肽类药物。目前已有报道对Bpi蛋白进行原核或真核重组表达[18-19],为开发出一种既能在促进伤口愈合的同时又能避免细菌感染的双功能新型多肽类药物打下基础。另外,Bpi除用于治疗革兰氏阴性菌感染性疾病外,还被开发出一系列Bpi衍生肽,如抗真菌药,抗血管形成类药等。Bpi作为一类潜在的新型药物,必然会在不久的将来被广泛地应用于临床医学、农业、养殖业等生物学领域,为许多疾病的治疗带来新的希望。