异甘草素通过Smad3/Arid2-IR/NF-κB轴改善顺铂诱导的急性肾损伤小鼠炎症反应

文 丹廖 媛李健春张宇韦樊均明

(1.西南医科大学附属医院肾病内科,四川泸州 646000;2.西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心,四川 泸州 646000;3.西南医科大学附属中医院肾病内科,四川 泸州 646000;4.成都医学院,成都 610000)

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是由多种因素导致的肾功能短时间内急剧降低的临床综合征,是一种发病率及死亡率均较高的临床危重疾病。在临床实践中,顺铂被广泛应用于各类癌症的化疗[1],这是导致AKI的重要因素,有研究指出约1/3患者在接受顺铂化疗后发生AKI[2],严重的不良反应大大限制了其临床使用。顺铂所致AKI的特征性病理改变是肾小管-间质急性损伤、炎症反应[3],反复注射也可导致慢性肾功能不全[4]。核因子-kB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是介导应激反应促肾炎症和纤维化[5]的靶分子,受药理学试剂等病理性因素激活时可促进下游各种炎细胞因子的表达,进而介导白细胞的趋化和黏附,导致肾急性充血水肿、大量炎症细胞浸润,对肾组织形成不可逆损害[6-7]。目前尚无可用于减轻AKI发生时炎症水平、保持器官功能、提升患者存活率的特效治疗药物,而通过抑制NF-κB通路可能是一种减轻AKI所致肾炎症、维护免疫系统功能的方法。

越来越多的证据表明,长链非编码RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs)在肾疾病中起着关键作用[8-9],Smad3在TGF-β1介导肾炎症和纤维化过程中是一个关键的中介[10],最近有研究发现LncRNA Arid2-IR的启动子区域存在与Smad3相结合位点,在肾炎性病变时可检测到Arid2-IR表达增加,而过表达Arid2-IR可调控后续NF-κB分子介导的炎性反应[11],据此推断Arid2-IR是一种新型促Smad3/NF-κB依赖的与肾炎症相关的长链非编码RNA,通过下调Arid2-IR的表达进而抑制Smad3/NF-κB信号通路活性可能是治疗AKI肾炎症的一种新方法。异甘草素(isoliquiritigenin,ISO)在近代研究中发现具有优良的抗肿瘤、抗氧化以及抗炎作用[12],在肝和肺部炎症中都可以减轻炎症反应对组织的损害[13-14],但目前关于其在AKI动物模型中的作用报道甚少。本研究拟通过观察异甘草素对顺铂诱导AKI小鼠肾的抗炎作用,并通过检测异甘草素对Arid2-IR/Smad3/NF-κB信号轴的影响,探讨其作用机制,为开发异甘草素在防治AKI相关疾病方面的药物价值奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康的SPF级C57BL/6雄性小鼠30只,体重18～22 g,8周龄,购于成都达硕实验动物有限公司[SCXK(川)2015-030],本动物实验中的无菌手术全程于西南医科大学SPF实验动物中心完成[SYXK(川)2018-065]。小鼠笼置于安静环境,室温23℃ ～26℃,相对湿度 45%～55%,明暗交替12 h,全实验过程予以普通饲料和自由饮水,正式实验前予以适应新喂养一周,实验过程中的所有操作符合西南医科大学动物伦理学标准和要求(2017DW027),实验过程中已遵守动物实验的3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

顺铂溶液(国药准字20040803,批号19030,江苏豪森公司);异甘草素(纯度：HPLC＞95%)(批号PRF9082923,四川普瑞法公司);总RNA提取试剂盒(批号Q5111,北京天根生化科技);逆转录试剂盒Go Script TM reverse Transcription System(批号A5001,美国 Promega公司);NF-κB兔单抗(批号AD120519,北京博奥森公司);Smad3兔单抗(货号9513S)、p-Smad3 兔单抗(货号 9520S)、p-NF-κB 兔单抗(货号3033)购于美国CST公司;IL-6鼠单抗(货号 ab9324,Abcam公司);IL-1β鼠单抗(货号sC-52012,Santa Cruz公司);ECL凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司);酶标仪(美国Bio Tek公司);Light CyclerR480II PCR仪(瑞士Roche公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组与处理

30只体重18～22 g的SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为NC组、AKI组、ISO-L组、ISO-H组和Irb组。除NC组外,其余各组均接受腹腔单次注射顺铂20 mg/kg,NC组腹腔注射等量生理盐水。顺铂注射后24 h后,ISO-L和ISO-H组分别灌胃异甘草素溶液7.5 mg/kg、30 mg/kg 3 d,Irb组灌胃厄贝沙坦溶液20 mg/kg 3 d,NC组和AKI组以等量生理盐水灌胃3 d。灌胃3 d后处死小鼠,取血置于4℃过夜;剖取右肾,剥去包膜并用PBS冲净血污,于4%多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脱水、石蜡包埋保存;左肾组织即可存储于-80℃冰箱。

1.3.2 血清肌酐、血尿素氮检测

采集血于4℃静置过夜后,于3500 r/min离心10 min后吸取上层血清,按照说明书操作检测血清肌酐、尿素氮检测。

1.3.3 肾形态学检查

采用HE、PAS等常规病理染色观察肾的病理变化：切片于65℃条件下烤2 h后,二甲苯脱蜡,经乙醇复水。HE、PAS染色严格按照说明书步骤操作。于光镜下通过HE染色观察肾结构病理改变,PAS染色观察肾组织的损伤产物沉积程度。

1.3.4 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学法检测肾中炎症指标IL-6、IL-1β的表达：切片经上述常规处理后,滴加过氧化氢阻断剂10 min,5%BSA封闭15 min,滴加一抗(1∶150),4℃过夜,加二抗后常温孵育1 h,以DAB显色剂显色,拍照后使用Image J软件对切片中阳性区域进行量化。

1.3.5 Western blot法测定蛋白水平

切取各组左肾皮质30 mg于500μL IP蛋白裂解液和10×PMSF混合液中,在冰上研磨,经机械匀浆后,冰上摇晃裂解30 min,提取总蛋白,考马斯亮蓝法测蛋白浓度,加5×Loading Buffer后于100℃煮10 min后上样,经SDS-PAGE胶电泳分离,于恒压100 V转膜,5%BSA室温封闭1 h,加一抗IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1 ∶1 000)、p-Smad3(1 ∶1 000)、Smad3(1∶1 000)、p-NF-κB(1 ∶1 000)、NF-κB(1 ∶1 000)、GAPDH(1：50 000)于4℃摇床过夜,后加HRP标记二抗(1∶3 000)于室温孵育1 h,滴加ECL发光液于Bio-rad凝胶成像系统成像。以目的蛋白与内参蛋白GAPDH的IOD值的比值作为其蛋白的相对表达量。

1.3.6 炎症因子和Arid2-IR的基因检测

取各组左肾皮质25 mg,用灭菌处理的眼科剪在提前预冷的裂解液RZ中剪碎至无肉眼可见颗粒,按照RNA simple Total RNA Kit试剂盒说明书操作从肾中提取肾组织总 RNA,最后加入 30μL Nuclease-Free Water 混 匀, Thermo Fisher NANODROP 2000分光分度计上测RNA浓度。制备逆转录反应体系,按照 Go ScriptTMreverse Transcription System试剂盒推荐比例配置：4μL 5×Reaction Buffer,1 μL PCR Nucleotide Mix(核苷酸混合物),1μL Go ScriptTMReverse Transcriptase(逆转录酶),1μL MgCl2(终浓度2.5 mmol/L,逆转录酶活性增强剂),8μL Nuclease-Free Water,吹打混匀。将5μL cDNA加入逆转录体系,混匀并离心后逆转录程序如下：25℃ 5 min,4℃ 1 h,70℃ 15 min;逆转录完毕加入80μL Nuclease-Free Water,-20℃保存备用。在 LightCycler® 480 II上机检测 Arid2-IR、IL-1β和IL-6的表达量,上机结果分析采用2-ΔΔCt进行分析,引物序列如表1,检测到的基因相对水平以GAPDH正常化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0对计量数据进行统计分析,组间两两比较用t检验,多组间用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,当P＜0.05示为差异具有统计学意义。

表1 Real-time PCR所用引物序列Table 1 The primer sequences of Real-time

2 结果

2.1 异甘草素对AKI小鼠一般情况的影响

各组小鼠均无死亡现象,AKI组小鼠体重较NC组活动减弱;相比AKI组,异甘草素及Irb干预可以明显改善小鼠活动度。

2.2 异甘草素对AKI小鼠肌酐、尿素氮的影响

与NC组相比,AKI组的血清肌酐和尿素氮明显增加;与AKI组相比,异甘草素干预可使血清肌酐和尿素氮均有下降(P＜0.05),且ISO-H组的血清肌酐和尿素氮低于Irb组,见图1A、1B。

2.3 异甘草素对AKI小鼠肾组织结构改变

HE染色可见,AKI组小鼠肾肾小管上皮细胞大量萎缩坏死,致小管间出现明显间隙,肾结构破坏严重;异甘草素干预可明显减少肾组织中肾小管上皮细胞的坏死,减小肾小管间病理性间隙,使肾结构恢复良好。PAS染色可见AKI组小鼠肾有明显紫红色糖原相关复合物的沉积,异甘草素干预可明显减少沉积物,见图1C。

2.4 异甘草素对AKI小鼠炎症指标的影响

与NC组相比,AKI组小鼠肾中 IL-6、IL-1β在基因与蛋白水平的表达均出现明显升高;与AKI组相比,异甘草素和厄贝沙坦干预均可显著下调IL-6、IL-1β在基因和蛋白水平的表达,见图2。

2.5 异甘草素对 AKI小鼠 Arid2-IR表达和Smad3、NF-κB 活性的影响

Real-time PCR结果显示,与NC组相比,AKI组肾组织Arid2-IR在基因水平表达显著升高,在异甘草素干预之后其表达均明显下调。Western blot结果提示,与NC组相比,AKI组肾组织中p-Smad3和p-NF-κB表达明显增加,在异甘草素干预以后,p-Smad3和p-NF-κB表达明显减少,表明异甘草素干预可以抑制AKI小鼠肾中Smad3/NF-κB信号通路的活性,见图3。

3 讨论

AKI病理变化过程中所涉及的机制包括氧化应激、炎症和凋亡等[15],其中炎症是一个消除病原体和介导受损组织修复的复杂过程,炎症水平过高可引起免疫系统紊乱、纤维化和组织损伤,其相关的机制涉及细胞因子的释放、中性粒细胞和巨噬细胞的聚集、损伤相关分子的释放[16]。本研究在顺铂诱导AKI小鼠模型上探讨异甘草素对AKI小鼠肾的保护作用及机制研究。研究结果显示,AKI造模后,肾病理结构严重损伤,肾中炎症因子的表达均显著上调;异甘草素干预后,受损的肾生理结构部分得到恢复,且炎症因子的表达显著下降,提示异甘草素具有较好的抗炎、改善肾结构的效果。

图1 异甘草素对顺铂诱导AKI小鼠肾病理结构的影响(HE、PAS)Note.A、B,SCr and BUN results of mice.C,HE and PASstaining results.Compared with control group,***P＜ 0.001,****P＜ 0.0001.Compared with AKI group,##P＜ 0.01,###P＜ 0.001,####P＜0.0001.Figure 1 Effect of isoliquiritigenin on renal morphology in AKI kidneys induced by cisplatin

图2 异甘草素对顺铂诱导AKI小鼠肾炎症水平的影响(IHC)Notes.A、B,Real-time PCR results of IL-1β and IL-6.C、D,Western blot result of IL-6 and IL-1β.E、F,IHCresults of IL-6 and IL-1β.Compared with control group,*P＜0.01,**P＜0.05.Compared with AKI group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 2 Effect of isoliquiritigenin on renal inflammatory markers in AKI kidneys induced by cisplatin

图3 异甘草素对顺铂诱导AKI小鼠肾Smad3/Arid2-IR/NF-κB轴水平的影响Notes.A,Real-time PCR results of Arid2-IR.B-D,Western blot results of p-Smad3,Smad3,p-NF-κB and NF-κB.Compared with control group,**P＜0.05,***P＜0.001,****P＜0.0001.Compared with AKI group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,####P＜0.0001.Figure 3 Effect of isoliquiritigenin on the activity of Smad3/Arid2-IR/NF-κB axis and in AKI kidneys induced by cisplatin

异甘草素是一种易溶于有机溶剂的异黄酮类化合物,提取自豆科植物甘草,其结构式见图4,在传统医学中用作生命增强剂,用于治疗咳嗽、流感以及解毒[17]。已有研究表明异甘草素具有广泛的药理活性,在抗炎、抗氧化、抗癌细胞增殖等方面疗效卓越,主要通过调控MAPK、PI3K/AKT等通路实现抗炎作用[18],但对顺铂诱导AKI所致肾炎症中的具体作用机制尚不明确。有研究显示异甘草素可通过下调NF-κB通路减轻骨关节炎症水平,在后续恢复过程中可下调TGF-β1/Smad3通路介导的病理性纤维化[19]。我们在研究中同样发现,异甘草素作用后,AKI小鼠肾组织中NF-κB和Smad3的活化程度出现显著下降,推测NF-κB是介导肾炎症的重要分子,它可通过在细胞核内活化并诱导多种炎症介质基因的表达,和Smad3共同导致肾损害及后续修复过程中的肾间质纤维化。我们的研究结果显示,异甘草素能有效缓解AKI急性病程中的炎症,以及减少修复过程中病理性纤维化。

LncRNA是一种人类非编码蛋白序列编码的、转录后长度大于200个碱基的RNA序列,已证实与包括肿瘤、异常代谢和炎症等多种病理生理过程相关[20]。前面我们提到,AKI所致的肾损伤主要涉及炎症、凋亡等,近年来随着检测技术的发展,越来越多与AKI相关的LncRNA被逐渐发现。如有研究显示MEG3可通过结合miR181b-5p使TNFα活化,导致肾炎症性损伤[21];PRINS可通过结合HIF-1α蛋白来加剧NF-κB介导的肾小管细胞损伤[22];GAS5在缺血再灌注的肾中可直接通过调节p53和TSP-1表达来介导细胞的损伤和凋亡[23]。近期有研究发现,Arid2-IR是一种可以被高表达Smad3所调控、并介导肾炎症的LncRNA,当病变肾中缺失Smad3时,可以解除Arid2-IR的上调,减少肾小管上皮细胞凋亡和炎症[11],同时Arid2-IR表达的上调可加剧NF-κB介导的肾炎症[24]。那么,异甘草素的抗炎作用是否与调控LncRNA有关呢?在本研究中我们重点关注了Arid2-IR在AKI发生中的作用,结果发现,Arid2-IR在AKI肾中表达明显升高,表明上游的靶基因Arid2-IR被激活。给予异甘草素3 d后,Smad3蛋白磷酸化水平表达明显下降,表明异甘草素可以降低AKI肾炎症中Smad3的活性。值得关注的是,异甘草素治疗后也可明显抑制Arid2-IR的表达,同时下调 NF-κB的活性。表明 Arid2-IR可能在Smad3/NF-κB介导的肾炎症过程中发挥调控作用。

图4 异甘草素分子式Figure 4 Constitutional formula of isoliquiritigenin

基于以上分析,我们初步得出,异甘草素可通过调节Smad3/Arid2-IR/NF-κB轴改善AKI小鼠肾功能,显著减轻肾炎症反应,维护肾结构,延缓了疾病病理生理进程,这可能是异甘草素保护AKI的一个新机制,为异甘草素在治疗AKI提供了科学依据。但关于Arid2-IR在肾损伤中的确切作用机制尚需细胞水平的验证。