对3个携带tRNALeu(CUN)12308A>G突变的Leber遗传性视神经病变家系的检测分析

王烜，梁敏，2，管敏鑫

（1.温州医科大学 检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

Leber遗传性视神经病变（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一种母系遗传的视神经疾病，由Leber于1871年首次描述了此病的临床症状而冠名。此病常发于男性青少年，为急性或亚急性，可双眼同时发生或相继发生，视力下降但不伴有转眼痛并且呈现出视盘周围神经纤维层肿胀和视网膜神经节细胞缺失等病变[1-2]。LHON与线粒体损伤存在着密切的关系，线粒体DNA突变是其主要致病分子基础。自1988年Wallance等发现第一个与LHON相关的突变位点m.11778G＞A以来[3]，相继报道过60多个与LHON相关的突变位点，其中线粒体复合体I上的ND1、ND4和ND6亚基是LHON有关突变热点区域，但对位于tRNA上突变位点的报道相对较 少[4]。本研究报道了3个具有典型LHON临床特征的中国汉族家系，经检测不携带3个主要原发突变位点，但是携带tRNALeu(CUN)上的12308A＞G突变。m.12308A＞G突变可能会导致tRNALeu(CUN)的结构不稳定[5-6]，从而影响线粒体功能。本课题组对3个先证者家系中患者和携带者进行了临床和分子遗传学评估，并进行了线粒体基因全序分析，发现m.12308A＞G突变可能与LHON有关。

1 对象和方法

1.1 对象 本课题组与河北邢台眼科医院合作，建立了LHON家系收集网络，在河北范围内收集临床上被诊断为LOHN的汉族患者295例，并收集了他们的外周血液和相应的临床资料，同时收集了316例汉族正常人血样作为对照。本研究通过温州医科大学伦理委员会批准，所有受检者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 眼科临床检查：对先证者和家系其他成员进行眼科临床检查，包括视力、视野、色觉、屈光度、眼压、眼底、瞳孔对光反射、视觉诱发电位（visual evoked potential，VEP）等检查。视力损害程度分级标准：正常≥0.3；一级视力损伤（轻度）0.1～0.3；二级视力损伤（中度）0.05～0.1；三级视力损伤（重度）0.02～0.05；四级视力损伤（极重度）光感～0.02；五级视力损伤为无光感[7]。

1.2.2 线粒体基因组突变分析：从3个家系先证者和其他母系成员的外周静脉中抽取3～5 mL外周静脉血，通过试剂盒（杭州易思得生物科技有限公司，DR0301050）提取血中DNA并用24对正反向线粒体引物进行DNA扩增。为了确定线粒体基因组的变异位点，用上述方法对3个家系的先证者进行线粒体全序扩增，通过DNAstar软件包中的SeqMan对24对正反向测序结果进行拼接，导出拼接的测序结果为FASTA格式，再与修正的线粒体DNA剑桥标准序列（Cambridge reference sequence，rCRS，NC_012920.1）[8]进行比对，查找突变位点。

1.2.3 线粒体单倍体型分析：根据24对正反向引物扩增的PCR产物得出线粒体全序，对3个先证者的线粒体DNA进行单倍体型分析，并将其归到不同的类型中[9]。

1.2.4 线粒体种系发生学分析：根据GenBank选取17种动物的线粒体序列，包括人（Homo sapiens）、大猩猩（Gorilla gorilla）、长臂猴（Hylobates lar）、鼠（Musmusculus）、斑马鱼（Danio rerio）、环尾狐猴（Lemur catta）、猕猴（Macaca mulatta）、 地中海猕猴（Macaca sylvanus）、白额卷尾猴（Cebus albifrens）、蜂猴（Nycticebus coucang）、倭黑猩猩（Pan paniscus）、黑猩猩（Pan troglodytes）、阿 拉伯狒狒（Papio hamadryas）、苏门答腊猩猩（Pongo abelii）、牛（Bos taurus）、红毛猩猩（Pongo pygmaeus）、马来跗猴（Tarsius bancanus）[10]，对线粒体上编码tRNALeu(CUN)的基因序列进行保守性比对，并计算第44位点的保守系数。

1.2.5 线粒体拷贝数分析：采用Roche荧光定量试剂盒，对先证者和正常对照进行荧光定量PCR检测。

1.3 统计学处理方法 采用Graphpad Prism 7软件对先证者和正常对照者的线粒体数目的百分比进行绘图和统计学分析。2组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征 3个家系均来自邢台，L23家系先证者为III-2，L157家系先证者为III-2，L362家系先证者为III-1。患者都是由于双眼视力同时渐进性无痛性下降就诊，且性别都为男性，发病年龄分别为13、14、11岁。对先证者进行了视力、眼底、屈光度等检查，诊断为LHON，视力损伤程度分别为轻度、中度、轻度，并伴有视盘色淡充血等症状，先证者的临床资料见表1，家系图见图1。对3个家系的外显率进行了分析，分别为9.1%、28.5%、27.2%。

2.2 线粒体基因组分析 抽取静脉血，提取DNA，通过PCR扩增目的片段，进行突变基因的分析，并与剑桥参考序列进行比对。本研究对先证者进行了3个主要原发位点的检测，分别扩增了其ND1、ND4和ND63个基因片段，对其是否含有原发位点m.3460G＞A、 m.11778G＞A和m.14484T＞C进行了筛查，发现3个先证者均不含3个主要原发位点。随后用24对正反向引物扩增了先证者和其母系成员的线粒体全序列并对突变位点进行了分析，发现3个先证者都携带位于D-loop上的73A＞G、263A＞G突变，16S rRNA上的1811A＞G、2706A＞G突变，ND2上的4769A＞G突变，COX1上的7028C＞T突变，ATP6上的8860A＞G突变和tRNALeu上的12308A＞G突变，3个家系母系成员突变位点集合见表2。选取的3个健康对照者（c1、c2和c3）与3个患者家系中的先证者线粒体序列见图2。

表1 3例家系先证者的临床资料

图1 L23、L157和L362家系图

通过对人、牛、鼠和猩猩等的mtDNA种系发生学进行分析，发现m.12308A＞G在3个先证者中高度保守，而316例正常对照中未发现12308A＞G突变位点。tRNA二级结构分析表明，12308A＞G突变位点位于tRNALeu(CUN)反密码子茎和s环的交界处（通用位点44位，见图3）。进一步对17个物种的种系发生学进行保守性分析发现，tRNALeu(CUN)的保守性系数为100%[11]，见图4。

2.3 线粒体单倍体型分析 单倍体型是位于mtDNA某一区域的一组相关联的SNPs位点。由于mtDNA缺乏组蛋白的保护且长期处于高浓度的ROS环境下导致mtDNA较于核基因更易突变[12]。随着这些变易位点的累积并以母系遗传的方式传递给后代的过程中，逐渐形成了不同的单倍体型[13]。单倍体型以发现的先后对照字母的顺序进行命名（由A到Z）[7，14]， 中国人群中主要存在A、B、C、D、F、G、M和Z等单倍体型[15]。本研究中的3个家系均属于H2单倍体型。

图3 tRNALeu(CUN)二级结构示意图

2.4 线粒体拷贝数分析 为了探究m.12308A＞G突变是否影响了线粒体数量，我们选取了3个家系的先证者（mL23、mL157、mL362）进行线粒体拷贝数的测定，同时选取3个无血缘关系的正常人（c1、c2、c3）做对照，引物序列见表3，测定结果见图5，对结果进行分析发现，mL23、mL157和mL362组线粒体拷贝数分别为对照组的79%、57%和91%，其中mL23和mL157组中患者线粒体拷贝数相对于正常对照者明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），说明突变位点tRNALeu(CUN)12308A＞G可能造成线粒体损伤，从而导致线粒体数量下降[16]。

3 讨论

m.11778G＞A是LHON亚洲人群中最常见的原发突变位点，线粒体复合体I的ND1、ND4和ND6亚基上的碱基突变是引起LHON的热点区域，但是编码tRNA的区域也是十分重要的。在以往的报道中已经发现了tRNA上的某些位点会影响线粒体功能从而导致线粒体疾病，例如tRNAMet4435A＞G会提高高血压的发病风险[17]，而tRNAThr15927G＞A会提高LHON的发病风险[18]。

本研究中3个家系都表现出典型的LHON发病特征，即发病者都为男性，发病年龄小，发病急，可双眼同时发生或相继发病。对先证者和其他母系成员线粒体全序进行基因分析，发现3个家系均携带tRNALeu(CUN)12308A＞G突变，而316例正常对照人群样本中未发现此突变位点，我们推测tRNALeu(CUN)12308A＞G可能与LHON发病有一定关系。

图4 17个物种突变位点保守性分析

表2 3个家系先证者突变位点集合

续表2

图5 线粒体拷贝数相对百分比比较

表3 线粒体拷贝数测定引物序列

本研究中3个LHON家系的外显率为9.1%、28.5%和27.2%，与已报道的m.14502T＞C和m.3394T＞C在汉族LHON患者中占比相近，但远远小于m.11778G＞A 突变的外显率（10～90%）[19]。

在tRNA二级结构图中，我们发现m.12308A＞G 突变在第44位上发生了碱基替换，17个物种的tRNALeu(CUN)序列在此位点高度保守。tRNALeu(CUN)第44位在tRNALeu(CUN)反密码子茎最后一位与s段的交接位点处。tRNA的二级结构常为三叶草结构，在20世纪70年代初科学家们用X射线衍生技术分析发现tRNA的三级结构为倒L形。tRNA三级结构的特点是氨基酸臂与TψC构成L的横，二氢尿嘧啶臂与反密码臂及反密码环共同构成L的竖，s段的作用是在tRNA的L型三级结构中负责连接这两个区域（D环-反密码子环和TψC-受体臂）[20-21]。在tRNA中第44位与第26位相互作用对tRNA三级结构的维持发挥一定作用[22]，推测此位点的改变可能影响tRNA三级结构的稳定性。

线粒体拷贝数是衡量线粒体数目的重要标志。我们选取了3个LHON家系的先证者进行线粒体拷贝数的测定，发现患者的线粒体数量相对于正常对照者明显减少，提示tRNALeu(CUN)12308A＞G突变会造成线粒体数量减少，从而使细胞供能障碍。

在不同遗传背景的LHON家系中，先证者均携带tRNALeu(CUN)12308A＞G突变且不携带3个发病率较高的LHON原发位点，说明tRNALeu(CUN)12308A＞G是LHON的潜在分子发病基础，但在携带该突变的家系中发病率较低与患者患病程度较轻说明突变本身不足以造成LHON的表型表达，提示可能有其他修饰因子对这些家系发病起协同作用，包括环境因素、核基因[23]、表观遗传修饰[24]、线粒体单倍体型等[25]。