纳米二氧化钛 (nTiO2) 对三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum) 光合系统的影响

廖兴盛，王一翔，陈佐泓，王璞，黄静颖，朱小山*

1.长沙学院生物与环境工程学院，湖南 长沙 410022；2.清华大学深圳国际研究生院，广东 深圳 518055

随着科技的不断进步，人工纳米材料（MNMs）已经在社会经济发展的各个行业中取得了日益广泛的应用。2005年到2014年，全球MNMs产品从54种增长到1814种（Vance et al.，2014）。伴随着MNMs的大规模使用，其环境暴露的风险也随之升高。据调查，2010年全世界 MNMs的产量约26.0×104—30.9×104t。大约0.4%—7.0%的MNMs会释放到水环境中（Keller et al.，2013）。MNMs对水生生物的影响已成为环境研究的热点问题。研究表明，水环境中 MNMs会影响水生生物的生长繁殖（Zhu et al.，2010a），并经食物链传递到生态系统不同营养级（Mansfield et al.，2015；Zhu et al.，2010b）。

在所有的 MNMs中，纳米二氧化钛（nanotitanium dioxide，nTiO2）的应用相对更加广泛。截至 2014年，大约 100种纳米技术产品使用 nTiO2（Vance et al.，2014），常见的应用包括光催化剂、化妆品、涂料等（Chen et al.，2011；Popov et al.，2005；Wang et al.，2014）。同时，nTiO2也是所有MNMs中产量最大的，其他 MNMs如纳米银的产量只有nTiO2产量的2%。根据调查，70%—80%的nTiO2被用于包括防晒霜在内的个人护理品行业（Piccinno et al.，2012）。而在日常洗漱以及在海滩景区防晒等场景中，个人护理品中的nTiO2有可能直接进入到水体中，对水生生物造成危害。根据模型估计，仅在2010年就有超过15000 t的nTiO2被排入水体之中（Keller et al.，2013；Gottschalk et al.，2009），因此亟需对nTiO2的环境风险进行充分评估。尽管目前已有大量关于nTiO2对浮游植物的毒性研究，但研究结论并不一致，一些研究证实nTiO2降低了藻类生长和总叶绿素含量（Metzler et al.，2011；Wang et al.，2008），而另一些研究却表明nTiO2对藻类的毒性极低（Griffitt et al.，2010）。这些相反的研究结果表明nTiO2对浮游植物的影响机制仍需深入研究。许多研究者认为nTiO2的毒性影响机制在于其能够诱导产生 ROS（Ochiai et al.，2010；Aruoja et al.，2009），干扰藻类细胞正常的氧化应激平衡，从而抑制藻类的生长和光合能力（Li et al.，2015），并引起DNA 损伤（Aruoja et al.，2009；Chen et al.，2012；Ma et al.，2012；Melegari et al.，2013）。然而，已有的研究主要关注短期暴露下nTiO2的毒性效应，而对暴露过程中浮游植物的应激反应变化缺乏认识。同时，尽管研究认为nTiO2暴露会干扰浮游植物叶绿体的正常光合活动，但对浮游植物与光合作用相关的基因表达在nTiO2胁迫下的变化研究还不深入。

综合考虑以上因素，本项研究将观察三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）在暴露过程中光合作用途径相关的生理生化指标的变化，主要是叶绿素a含量、Fv/Fm（PS Ⅱ反应中心的最大光量子产量）、光合作用基因rbcS和LcyB的mRNA表达量的变化，探讨nTiO2对海洋微藻的光合毒性效应以及海洋微藻在nTiO2暴露下的响应机制。

1 材料与方法

1.1 实验生物、材料及仪器

本研究选用的藻种为三角褐指藻购买自上海光语生物科技有限公司。选择三角褐指藻为受试生物的原因在于三角褐指藻为海洋硅藻，对全球碳循环和硅循环具有重要的作用（Mann，1999）；同时三角褐指藻是模式生物，具有完整的基因组信息（Apt et al.，1997），便于开展相关基因的表达研究。实验采用的nTiO2（99.8%，粒径约15 nm）购自埃普瑞复合材料有限公司。超声波清洗机（KQ2200）购自昆山市超声仪器有限公司，人工气候箱（RZH-128A）购自杭州汇尔仪器设备有限公司，浮游植物荧光仪（Phyto-PAM）购买自德国WALZ公司，荧光定量PCR仪（ABI PRISM 7000）为美国产品。

1.2 培养条件

三角褐指藻在人工气候箱中进行静置培养，每天摇晃3次，培养温度为 (20±1) ℃，光照强度为3000 lx，光照周期为 12 h∶12 h（昼∶夜），所用的培养液为f/2培养基（Guillard et al.，1962）。每6天转接一次，转接时的起始浓度为2×104ind·mL-1。实验用海水采自深圳东涌，并用0.45 μm的滤膜过滤。取过滤海水配制f/2培养液。

1.3 实验体系

暴露组nTiO2质量浓度设置为5、10、20、50、100 mg·L-1，每个浓度设置3个平行。同时设置nTiO2对照组，即不加纳米材料（0 mg·L-1）正常培养的三角褐指藻。取0.2 g nTiO2用f/2培养基定容至0.2 L并超声波处理30 min作为母液。将母液逐级稀释配成浓度为暴露浓度两倍的悬浊液。将4×104ind·mL-1的藻液50 mL移至各个150 mL锥形瓶中，随后加入配好的nTiO2悬浊液50 mL，得到最终的试验液。试验液中藻密度为 2×104ind·mL-1，nTiO2质量浓度为 0、5、10、20、50、100 mg·L-1。随后每 24 h 测定一次，总实验周期为120 h。

1.4 叶绿素和Fv/Fm的测定

首先以对数期藻液作为参照对 Phyto-PAM 进行标定。从各处理组和对照组藻液中取样，避光静置5 min，测量叶绿素a含量和Fv/Fm。依照nTiO2对三角褐指藻叶绿素a含量影响的结果计算各暴露组在处理24—120 h后的抑制率。公式如下：

式中，In表示叶绿素的抑制率（%）；C0和Cn分别表示对照组和处理组中叶绿素 a的含量（μg·L-1）。

1.5 实时荧光定量 PCR

培养 48 h和 120 h后，分别从对照组和 10 mg·L-1nTiO2暴露组中各取藻液40 mL，12000 rpm离心10 min获得藻细胞。然后提取RNA，具体方法依据说明书（E.Z.N.A.Total RNA Kit II，Omega）进行。提取 RNA后进行反转录获得与三角褐指藻RNA碱基序列互补的 cDNA。使用实时荧光定量PCR仪（ABI PRISM 7000，美国）进行检测。相关试剂采用 SYBR Prime RT-PCR Kit（TaKaRa）。反应条件如下：预变性95 ℃，30 s，变性95℃ 5 s，退火和延伸64 ℃ 30 s，共计循环40次。实时荧光定量所用PCR引物序列如表1所示。以同一时间点无nTiO2组中的一个样品作为对照（即该样品中目的基因的表达量设定为1），使用2-△△Ct方法计算每个基因的相对表达水平（Livak et al.，2001；Schmittgen et al.，2008）。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the present study

1.6 统计分析

对照组与暴露组的显著性差异统计使用 SPSS 20进行单因素方差分析，P＜0.05则认为对照组与暴露组的结果之间存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 nTiO2对三角褐指藻叶绿素a含量的影响

nTiO2暴露下的三角褐指藻叶绿素 a相对含量变化如图1所示，随着nTiO2暴露浓度的升高，三角褐指藻叶绿素 a含量均有不同程度的下降。100 mg·L-1nTiO2处理组在全部暴露时长下叶绿素a含量均显著低于对照组。暴露24 h时，对照组的叶绿素a含量显著高于各个暴露组（P＜0.05）；120 h时，只有100 mg·L-1暴露组的叶绿素a含量显著低于对照组（P＜0.05）。以对照组、10 mg·L-1和 100 mg·L-1处理组为例，24 h 时 10 mg·L-1和 100 mg·L-1组的叶绿素 a含量分别为对照的 (84.8%±6.6%)和(40.3%±8.2%)。120 h 时 10 mg·L-1和 100 mg·L-1这两组的叶绿素 a含量分别为对照的 (94.5%±0.3%)和 (88.4%±1.1%)。结果表明，三角褐指藻的叶绿素a含量在 nTiO2暴露下呈现出先下降后上升的恢复趋势，这与先前研究发现的三角褐指藻细胞生长受nTiO2暴露下先抑制后恢复的现象类似（Wang et al.，2016）。

图1 不同浓度nTiO2处理24—120 h三角褐指藻叶绿素a的含量Fig.1 The contents of chlorophyll a in treatments with various concentrations of nTiO2 for 24-120 h

叶绿素a抑制率如图2所示，可见24 h和48 h时，暴露组的抑制率较高，且随着暴露时间的增加抑制率逐渐降低。10 mg·L-1和 100 mg·L-1处理 24 h的抑制率分别为 (15.2%±6.6%)和 (59.6%±8.2%)，120 h 为 (5.5%±0.3%)和 (11.6%±1.1%)，抑制率显著下降。与此同时我们将所得到的数据进行拟合，各浓度的线性拟合斜率均小于零（表2），进一步说明光合作用抑制率随暴露时间存在下降趋势；且nTiO2浓度越高，拟合斜率的绝对值越大，抑制率下降越明显。

图2 nTiO2暴露对三角褐指藻生长的抑制率随时间的变化趋势Fig.2 Inhibition rate on P.tricornutum growth in response to nTiO2 exposure at various time

表2 不同nTiO2浓度下三角褐指藻生长的抑制率与时间的回归方程Table 2 Regression equations of inhibition rate in P. tricornutum and time at each nTiO2 concentration

2.2 nTiO2对三角褐指藻光合系统II最大光量子产量（Fv/Fm）的影响

叶绿素荧光是光合作用能量转换的探针，叶绿素荧光参数Fv/Fm代表光合作用 PS Ⅱ反应中心的最大光量子产量，是测量藻类的生长和光合作用的典型指标（Genty et al.，1989），能够有效地反映藻类受胁迫的程度。本试验中，对照组在 72 h之后Fv/Fm达到了最大，说明了这段时间是三角褐指藻进入新的环境时的适应期（图3a）。暴露组中除去5 mg·L-1以外其他各组48 h的Fv/Fm均显著低于对照组（P＜0.05）。48 h以后，所有暴露组的Fv/Fm与对照组相比均没有显著差异（P＞0.05）。表明三角褐指藻对新的环境出现了适应性。暴露的前期阶段nTiO2抑制了三角褐指藻的光合系统中光量子的产量，从而影响了叶绿素的含量。48 h后nTiO2对光合系统II最大光量子产量失去了影响，从而使得三角褐指藻对于环境中的nTiO2胁迫表现出了抗性行为或适应行为。

2.3 nTiO2对三角褐指藻光合色素相关基因表达的影响

由叶绿素a和Fv/Fm的变化趋势可知，随着暴露时间延长或者暴露浓度上升，nTiO2对三角褐指藻的抑制作用均呈下降趋势。这种抑制的减弱作用应该在某些光合色素相关基因的表达水平上有所体现。本实验选取光合作用相关基因，包括番茄红素β-环化酶基因（LcyB）、八氢番茄红素合成酶基因（Psy）、八氢番茄红素脱氢酶基因（Pds）等类胡萝卜素合成途径中的重要基因，以及光合碳同化的关键酶核酮糖-1, 5-二磷酸梭化酶/加氧酶（Ribulose-1, 5-bisphophate carboxylase，Ruibsco）小亚基 rbcS。然后检测其表达水平，从而从基因的层面发掘nTiO2对三角褐指藻的影响。跟据Fv/Fm的结果，当暴露浓度大于等于10 mg·L-1时，各处理组前48 hFv/Fm显著低于对照（P＜0.05）。但这一差异在72 h后消失，因此本研究选择10 mg·L-1组在暴露48 h和120 h后进行基因表达分析，结果如图4所示。10 mg·L-1nTiO2暴露下基因 Psy的表达量在 48 h（第2天）和120 h（第5天）与对照组都没有显著性差异（P＞0.05）。在第2天和第5天相同浓度下。Pds的表达也都显著低于对照（P＜0.05）。LcyB和rbcS是 48 h（第 2天）后表达量显著地低于对照（P＜0.05），而 120 h（第 5天）表达显著高于对照（P＜0.05）。LcyB第2天和第 5天的相对表达量分别为对照组的 (30.4%±1.5%)和 (164.1%±7.4%)。rbcS在第2天和第5天相对表达量分别为对照组的(21.2%±7.1%)和 (192.8%±12.2%)。

2.4 nTiO2对三角褐指藻光合系统的影响机制探讨

图3 不同浓度nTiO2处理24—120 h三角褐指藻Fv/FmFig.3 Fv/Fm in treatments with various concentrations of nTiO2 for 24-120 h

MNMs对微藻的生长抑制已经被广泛报道。在所有的MNMs中，nTiO2被认为对藻类的毒性最低。如在一项关于MNMs对月牙藻（Crescent algal）毒性的相关研究中，与纳米氧化锌和纳米氧化铜相比，nTiO2的毒性效应最低（Aruoja et al.，2009），此外 nTiO2的低毒性效应也表现在对拟南芥（Arabidopsis thaliana）部分基因表达的抑制中。据报道，与富勒烯和纳米氧化锌相比，拟南芥受nTiO2影响而下调的基因数量最少（Landa et al.，2012）。已有的报道中，nTiO2对新月菱形藻（Crescent lozenge）的 96 h 的 EC50为 88.78 mg·L-1（Xia et al.，2015），对短凯伦藻（Karenia brevis）和中肋骨条藻（Skeletonema costatum）的72 h的EC50分别为10.69 mg·L-1和 7.37 mg·L-1（Li et al.，2015），对月牙藻的 72 h 的 EC50为 9.73 mg·L-1（Aruoja et al.，2009）。此外，在一项同样以叶绿素a的含量计算抑制率的研究中，小球藻（Chlorella）和栅藻（Scenedesmus）在 72 h 的 EC50分别为 16.12 mg·L-1和 21.20 mg·L-1。与之相比，本研究通过测定叶绿素a而得到抑制率，在最高浓度100 mg·L-1下，24 h和48 h的抑制率大于50%，而72 h及以后其抑制率就已经低于50%，表明nTiO2对三角褐指藻的抑制效应更低。

图4 nTiO2对三角褐指藻光合作用相关的基因转录的影响Fig.4 Effects of nTiO2 on the transcription of genes related to photosynthesis in P. tricornutum

尽管本研究表明nTiO2对三角褐指藻的抑制不明显，但抑制效果与暴露时间有紧密的关系。在暴露 24 h（1 d）时 100 mg·L-1nTiO2的抑制率为(59.7%±8.2%)，5 d 后 100 mg·L-1nTiO2的抑制率为(11.6%±1.1%)。而且 10—100 mg·L-1nTiO2暴露 24 h和48 h后Fv/Fm显著低于对照（P＜0.05），3天后却与对照无显著差别（P＞0.05）。Chen et al.（2012）也同样发现 10 mg·L-1以上浓度的nTiO2在前 12 h显著地抑制了莱茵衣藻的Fv/Fm，随后 nTiO2处理组中莱茵衣藻逐渐恢复到对照组的水平。本实验中nTiO2对三角褐指藻的抑制随着暴露时间的延长而减弱，而这种逐渐减弱的趋势可能与三角褐指藻对nTiO2的抗性或适应行为有关。随着暴露时间的延长，三角褐指藻可能通过某些基因如LcyB和rbcS的上调，抵抗nTiO2的不利影响。

rbcS与 1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶有直接联系，它是光合作用固定碳的关键酶（Miziorko et al.，1983）。已有的文献表明暴露于 nTiO2的菠菜（Spinacia oleracea）中，Rubisco活性显著上升（Gao et al.，2008）。本研究显示三角褐指藻rbcS表达量在2 d时出现显著下调（P＜0.05），5 d时恢复至正常水平。这与本研究中叶绿素a的变化类似。刚加入nTiO2时，藻中的rbcS对nTiO2比较敏感，表达量降低，藻的光合作用受到抑制。光合作用会产生大量的电子，1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶可以催化光呼吸过程的第一阶段，从而猝灭多余的电子，对植物起到保护作用（Niyogi，2000）。因此可以推断，rbcS由2 d的下调到5 d的上调，一方面表现为藻对nTiO2暴露的适应过程中生物量的累积，另一方面可能表现为光合系统的稳定性提高。

番茄红素合成β-胡萝卜素的关键基因是 LcyB（Bai et al.，2009）。番茄中LcyB的大量表达会显著的增加β-胡萝卜素在番茄中的含量（Wiebke et al.，2009）。β-胡萝卜素是植物光合系统第二阶段的反应中的重要组成部分（Nanba et al.，1987）。此外，nTiO2的存在会导致浮游植物体内活性自由氧的含量上升，产生氧化应激（Li et al.，2015；Wang et al.，2008），而β-胡萝卜素是有效的活性自由氧猝灭剂（Pinto et al.，2003）。综上，LcyB由第2天的下调到第5天的上调，一方面可能表现为光合系统II更加稳定，这与光合系统II最大光量子产量的结果相符，另一方面可能表现为抵抗nTiO2所导致的氧化压力的能力逐渐提升。

3 结论

本研究通过观察三角褐指藻在nTiO2暴露过程中光合作用途径相关的生理生化指标的变化，探讨nTiO2对三角褐指藻的光合毒性效应以及三角褐指藻在nTiO2暴露下的响应机制，结果发现，（1）nTiO2对三角褐指藻的毒性效应较低，且nTiO2对三角褐指藻叶绿素a相对含量和Fv/Fm的抑制效应随着时间的延长而衰减，表明三角褐指藻对nTiO2胁迫可能具有适应能力。（2）藻光合色素相关基因rbcS和LcyB可能在三角褐指藻对 nTiO2暴露的抵抗过程中起到了重要的作用。考虑到海洋微藻对于MNMs暴露的抗性，在以后的人工纳米材料环境影响评价中可以考虑其对环境的短期和长期效应，并对暴露期间海洋微藻生理活动变化给予更多的关注。